抗生素抗性基因在长江口滨岸沉积物中的赋存特征研究

作     者：赵赛 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨毅;刘敏

授予年度：2020年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：长江口滨岸沉积物 ARGs 年际分布 环境影响因子 胞内胞外DNA 

摘      要：环境中尤其是在沉积物中,ARGs(Antibiotic resistance genes,ARGs)广泛且大量存在。同时,沉积物组成复杂,粒径多样,对不同形式存在的ARGs赋存可能有不同影响。河口区域作为连接陆地和海洋的重要过渡区域,该区域咸淡水相互作用、潮汐作用强烈、环境条件复杂、耦合过程多变、演变机制复杂且受人类活动影响剧烈。在这个较为复杂的生态系统中,长期时间尺度及不同粒径下的ARGs的分布、含量及影响环境因子如何,尚需要研究。在前期课题组对长江口滨岸带沉积物中ARGs的赋存与分布的研究基础上,本文进一步选择两个典型沉积物样品(LHK和WSK),通过普通PCR(polymerase chain reaction)和定量qPCR(quantitative-polymerase chain reaction)技术分别定性和定量不同年份(2007-2019)沉积物中ARGs的种类和丰度;利用UPLC-MS-MS和ICP-MS等技术分别测定沉积物中抗生素和弱酸提取态金属含量;收集社会经济数据并和ARGs、抗生素、弱酸提取态金属及理化指标进行相关性分析,来探究社会经济及环境因子对ARGs赋存的影响;利用斯托克斯沉降虹吸法对沉积物进行粒径分离,并探究了湿样、干样、超声和振荡条件下,不同粒径中ARGs的分布特征及贡献率;采用NaHPO-SDS-PVPP结合法对沉积物胞内DNA(iDNA)和胞外DNA(eDNA)进行分离;运用CTAB法和3S Kit法纯化和提取iDNA和eDNA,并探究其对应条件下,不同粒径以iDNA和eDNA存在的ARGs的分布特征及贡献率。基于上述研究,主要得到以下结论和认识:(1)长江口滨岸沉积物不同年份中,ARGs(sul1、sul2、tetA、tetM、tetW、qnrS、aac(6’)-Ib)及其相关基因(intI1基因移动元件和zntA、copA等金属抗性基因)普遍存在,且其年际变化规律不一。其中,sul1、sul2、tetM、tetW、qnrS、aac(6’)-Ib和zntA呈现逐年上升趋势;tetA呈现相对稳定趋势;intI1和copA不同年份没有明显变化趋势。同时,近年来ARGs的类型和丰度均普遍高于前几年。ARGs的空间变化特征为,有城市污水排放和城市内河输入的采样点(WSK)高于城市内河输入的采样点(LHK)。(2)大部分社会经济指标呈现逐年上升趋势,而抗生素含量、弱酸提取态金属的年际变化特征不太明显。沉积物理化性质中TOC呈现逐年上升趋势,而pH值、盐度、粒度(粘粒、粉粒及砂粒)的年际变化基本不明显。ARGs与社会经济数据、环境因子之间的相关性分析表明:大部分社会经济指标与其对应的抗生素含量、弱酸提取态金属含量、TOC含量呈正相关或显著正相关。大多数社会经济指标与若干ARGs具有显著相关性。抗生素总浓度与对应的ARGs相关性不显著,但某些特殊抗生素种类与相对应的ARGs有显著相关性。弱酸提取态金属浓度与大多数ARGs有显著相关性。以上结果说明社会经济发展可能会增加沉积物中抗生素、有机物、金属和ARGs的含量,并且抗生素、有机物、金属可能会参与调节沉积物ARGs发生和赋存。同时,TOC、pH值和粘粒可能也是影响沉积物ARGs年际丰度变化的主要因素。(3)分别利用湿样、干样、超声和振荡方法对沉积物进行粒径分离,四种方法下,16S rRNA、sul1和tetA的分布特征均表现为((1-20μm)总沉积物(63μm)(20-63μm);根据质量平衡,16S rRNA、sul1和tetA三个目的基因在各粒径的量在沉积物总量的贡献占比为(1-20μm)((20-63μm)(63μm),且1-20μm占据主导地位。提取基因丰度结果表明湿样优于干样条件,而超声和振荡并没有显著区别。(4)采用NaHPO-SDS-PVPP结合法对沉积物胞内DNA(iDNA)和胞外DNA(eDNA)进行分离,并分别利用超声、振荡、CTAB法和3S Kit法对沉积物不同粒径DNA进行提取与纯化,四种方法下,以iDNA存在的16S rRNA、sul1和tetA分布特征为(1-20μm)总沉积物((20-63μm)(63μm)。而以eDNA存在的16S rRNA、sul1和tetA分布特征为((1-20μm)总沉积物(63μm)(20-63μm)。在提取iDNA时建议采取CTAB法,在提取eDNA时建议采取3S法。根据质量平衡,无论是总量还是不同粒径中,eDNA对总ARGs的贡献率均高于对应的iDNA,表明沉积物的eDNA是ARGs的重要储存库,且具有较强的转化与传播能力。