IL-37d对肿瘤转移前微环境和肿瘤转移的影响及机制

作     者：关叶桐 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张利宁

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：IL-37d 肿瘤微环境 肺转移前灶 中性粒细胞浸润 中性粒细胞自发迁移 

摘      要：研究目的IL-37是一种新的免疫负调控分子,于2000年被发现,属于IL-1家族。IL-37包括5种剪切体（IL-37a-e）,IL-37b是最大的一种亚型,在人的器官和组织中广泛表达,目前关于IL-37的研究主要集中在该亚型,发现IL-37b不仅参与调节多种炎症性疾病（如系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、银屑病、急性冠状动脉综合征、类风湿性关节炎等）的进展,并且还在多种癌症中发挥抗肿瘤效应（如纤维肉瘤、肝细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、非小细胞肺癌等）。IL-37d较IL-37b仅少一个外显子2,预测可能也是有功能的亚型,本实验室前期已经构建了IL-37d转基因小鼠,并在内毒素血症模型中证明了IL-37d一样具有抗炎作用,但目前有关于IL-37d在肿瘤中作用的研究尚不清楚。本课题利用IL-37d转基因小鼠,采用小鼠B16/F10黑色瘤细胞和LLC肺癌细胞建立皮下移植瘤和肺转移模型,研究了 IL-37d在肿瘤生长、转移中的作用;从肿瘤转移前微环境和肿瘤相关中性粒细胞入手研究了 IL-37d对肿瘤转移前灶中中性粒细胞侵润及骨髓来源的中性粒细胞自发迁移的影响并初步探讨了其作用机制。本论文包括四部分内容:一、IL-37d对小鼠皮下B16移植瘤生长的影响;二、IL-37d对B16和LLC肺转移瘤进展和小鼠存活率的影响;三、IL-37d对肿瘤微环境中肿瘤相关中性粒细胞浸润的影响及机制;四、IL-37d对肿瘤诱导骨髓中性粒细胞自发迁移的影响和机制。研究方法一、IL-37d对小鼠皮下B16移植瘤生长的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠背部接种小鼠B16/F10黑色瘤细胞,建立皮下移植瘤模型,从第8天长出肿瘤后,开始隔天测量小鼠背部肿瘤大小,当小鼠肿瘤达到100m m2将原发肿瘤剖离并进行称重、瘤体大小测量和外观拍照。检测IL-37d对皮下原发瘤生长的影响。二、IL-37d对B16和LLC肺转移瘤进展和小鼠存活率的影响（一）活体成像检测IL-37d对肺转移瘤进展的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种带荧光标记的B16/F10和LLC细胞,构建肺转移瘤模型于1W、2W、3W时利用山东大学转化医学共享平台的离体荧光素酶的无创生物发光成像对小鼠进行活体成像,检测肺部肿瘤的进展情况。在小鼠出现死亡后（3W左右）解剖尸体对肺进行外观拍照、称重并取小鼠肺组织切片进行包埋。（二）IL-37d对转移瘤小鼠生存率的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种B16/F10和LLC细胞,构建肺转移瘤模型,每日称重,观察小鼠的生存状况,记录每只小鼠的死亡时间。小鼠死亡后解剖尸体对肺进行外观拍照、称重并取小鼠肺组织切片进行包埋。三、IL-37d对肿瘤微环境中肿瘤相关中性粒细胞浸润的影响及机制（一）PAS染色和流式细胞方法检测IL-37d对转移瘤肺部中性粒细胞数量的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种LLC细胞,构建肺转移瘤模型,在1W时对小鼠进行解剖,对肺进行外观拍照、称重,并取一部分肺组织进行包埋和制备组织切片,进行PAS染色观察组织细胞形态以及肺部中性粒细胞募集多少情况;取另一部分肺组织制备单个细胞悬液,用PE-Cy7标记的抗CD11b的抗体和PE标记的抗LY6G的抗体染色后,通过流式细胞术检测小鼠肺脏组织中中性粒细胞的数量变化情况。（二）实时定量PCR和免疫组化的方法检测IL-37d对转移瘤模型中肺部中性粒相关分子表达的影响1.通过实时定量PCR的方法检测肺转移瘤进展过程中肺部中性粒相关分子表达的动态变化分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种LLC细胞,构建肺转移瘤模型,分别在1W、2W、3W时对小鼠进行解剖,对肺进行外观拍照、称重,肺脏组织提取总RNA并逆转录成cDNA,然后采用荧光定量PCR检测S100a8、S100a9、mmp9、TLR3、CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL5、CXCR2、CXCR4和CXCR7以及IL-6,TNF-α,IL-1 β在肺部表达情况,确定转移瘤形成过程中肺部中性粒相关分子表达的动态变化。2.采用实时定量PCR和免疫组化的方法,分析IL-37d对肿瘤转移早期肺部中性粒相关分子表达的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种LLC细胞,构建肺转移瘤模型,于接种肿瘤满1W时,对小鼠进行解剖,对肺进行外观拍照、称重并取小鼠肺组织切片进行包埋,利用TLR3、S100a8/9和MMP9特异性抗体进行免疫组织化学染色,检测TLR3、S100a8/9和MMP9的表达;提取小鼠肺脏组织RNA,检测S100a8,S100a9和mmp9的表达。四、IL-37d对肿瘤诱导的骨髓中性粒细胞自发迁移的影响和机制（一）通过Transwell和流式细胞术检测IL-37d对骨髓中性粒细胞自发迁移能力的影响分别给6-8周的雄性C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠尾静脉接种LLC细胞,构建肺转移瘤模型,于接种肿瘤满1W和2W时对小鼠进行解剖,取骨髓制备单个细胞,去除红细胞后,采用免疫磁珠法从小鼠骨髓中分离纯化出LY6G+标记的中性粒细胞,通过流式细胞术检测分离出的中性粒细胞的纯度;提取出的中性粒细胞,采用Transwell进行迁移实验,然后通过计数统计迁移的中性粒细胞数目。（二）采用Rac1特异性抑制剂分析否通过Rac1通路影响骨髓中性粒细胞的迁移能力为了探讨L-37d是否通过Rac1通路影响骨髓中性粒细胞的迁移能力,我们采用Rac1抑制剂阻断Rac1活性,然后再按上述方法进行迁移实验。结果一、IL-37d抑制皮下移植瘤的生长本实验室前期已经利用IL-37d转基因小鼠在LPS诱导的内毒素血症模型中研究了IL-37d对炎症的抑制作用,但其对肿瘤生长、转移和肿瘤微环境的影响尚不清楚。首先为了探究IL-37d在肿瘤中所发挥的直接作用,在C57BL/6 WT和IL-37d转基因小鼠背部右侧接种了 B16/F10黑色瘤细胞,制备了皮下成瘤模型。通过肿瘤生长曲线和瘤重分析,发现IL-37d转基因小鼠的肿瘤生长较WT小鼠缓慢,肿瘤重量较小。提示IL-37d可以抑制小鼠皮下原发瘤的生长。二、IL-37d对肺转移瘤进展和小鼠存活率的影响（一）IL-37d对肺转移瘤进展的影响为了研究IL-37d肿瘤转移的影响,我们利用带有荧光素酶标记的小鼠黑色素瘤细胞（B16/F10）以及肺癌细胞（LLC）,通过小鼠尾静脉注射肿瘤细胞以构建肺转移模型,分别于注射肿瘤后1W、2W和3W,通过活体成像分析IL-37d对肺转移瘤进展的影响。我们发现在两种不同的肺转移模型中,IL-37d小鼠肺转移肿瘤细胞的荧光强度较WT小鼠均有降低的趋势,三周活体成像后,处死小鼠解剖发现野生型肺内肿瘤的大小和数量均大于或多于IL-37d组小鼠。提示IL-37d具有抑制肺转移瘤进展的作用。（二）IL-37d对肺转移瘤小鼠存活率的影响为了确定IL-37d对肿瘤转移的影响,我们利用尾静脉注射B16细胞LLC细胞构建肺转移模型,进一步观察了 IL-37d对转移瘤小鼠的生存状况的影响。结果发现,B16细胞的转移瘤模型中,IL-37d可以有意义增加荷瘤小鼠的存活时间,平均生存时间:WT组为29.3天、IL-37d组为36.7天,35天时,WT小鼠全部死亡,而IL-37d组50天时仍有1只存活,解剖后发现肺内肿瘤不明显。在小鼠LLC细胞的转移瘤模型中,IL-37抑制肿瘤的作用更明显,到第60天时,WT组小鼠的生存率为16.7%（1/6）,而IL-37d组小鼠100%存活（6/6）。解剖剩余存活小鼠,2只存活的WT小鼠,尽管肺部无明显转移灶,但在皮肤和肾脏发现了转移灶;6只存活的IL-37d小鼠中有3只小鼠肺有明显肉眼可见的转移灶,其他三只无明显转移灶。这些结果说明IL-37d可明显提高肺转移瘤小鼠的存活时间和存活率的影响。三、IL-37d对肿瘤转移前灶微环境中中性粒细胞浸润的影响及机制（一）IL-37d对转移瘤小鼠肺内中性粒细胞侵润的影响近年来的研究显示中性粒细胞在肿瘤转移早期发挥重要作用,具有促进肿瘤进程的作用。故为了探讨IL-37d抑制肿瘤的机制,利用LLC细胞构建肺转移瘤模型,采用了碘酸雪夫染色（PAS染色）和流式细胞术的方法,分析了IL-37d对肿瘤转移早期（1W）肺内中性粒细胞浸润数量的影响。PAS染色发现IL-37d小鼠肺内中性粒细胞的浸润数量明显少于WT组;流式细胞术分析小鼠新鲜肺组织中CD11b+Ly6G+标记的中性粒细胞,发现IL-37d能明显抑制肿瘤转移早期（1W）肺中中性粒细胞浸润的数量,而对肿瘤转移晚期（即3W时）肺内中性粒细胞的数量没有影响。说明IL-37d主要是在肿瘤转移早期抑制中性粒细胞在肺里的募集。（二）IL-37d对转移瘤小鼠肺内中性粒相关分子表达的影响1.肺转移瘤进展过程中肺内中性粒相关分子表达的动态变化为了探究IL-37d抑制肿瘤转移早期肺内中性粒细胞募集的分子机制,我们首先利用尾静脉注射LLC细胞构建肺转移模型,采用实时荧光定量PCR的方法,分别于注射肿瘤细胞后1w、2w、3w分析这些分子的动态变化。结果发现在肿瘤注射1周后,利于肿瘤细胞侵袭的中性粒细胞相关分子—TLR3、S100a8、S100a9、MMP9和中性粒细胞相关趋化因子—CXCL1、CXCL2明显上调,而其他促炎性细胞因子—IL-6、IL-1β在注射肿瘤细胞后3周才升高,说明肿瘤转移早期肺部免疫微环境主要是中性粒细胞相关分子的改变。2.IL-37d对中性粒细胞趋化因子和趋化因子受体的影响上述动态分析提示肿瘤转移的早期（1W）肺内中性粒细胞趋化因子（CXCL1和CXCL2）升高。为此,我们首先检测IL-37d对CXCL1和CXCL2表达的影响,结果发现肿瘤转移早期（1W）,IL-37d和WT组荷瘤小鼠肺中CXCL1和CXCL2表达均高于无肿瘤的对照组小鼠,但两组间没有明显差异,说明IL-37d对CXCL1和CXCL2的表达无明显抑制作用。进一步我们探索了IL-37d对其他中性粒细胞趋化因（CXCL5和CXCL12）表达的影响,结果发现IL-37d对CXCL5和CXCL12的表达也没有明显的影响。进一步我们考虑IL-37d也许是影响了趋化因子受体的表达而影响了细胞对趋化因子的敏感性,故我们又检测了 IL-37d对趋化因子受体-CXCR2、CXCR4和CXCR7表达的影响,结果发现IL-37d对这些趋化因子受体表达也没有明显的影响。上述结果说明IL-37d不是通过抑制中性粒细胞趋化因子和趋化因子受体而减少中性细胞在肺内的募集。3.IL-37d对肿瘤转移早期肺内TLR3表达的影响有研究提出肺上皮细胞上的Toll样受体3（TLR3）是感应肿瘤外泌体RNAs,启动中性粒细胞募集到肺转移前灶微环境并促进肺转移形成的关键。故我们提出假设:IL-37d抑制中性粒细胞在肺中募集浸润是否是通过抑制肺上皮细胞TLR3表达来发挥作用的。我们分别采用实时荧光定量PCR、Western Blot和免疫组化的方法检测了 TLR3在转移早期（1W）肺组织中的表达。实时荧光定量PCR、Western Blot的结果显示IL-37d有抑制TLR3 mRNA和蛋白表达的趋势,但无统计学意义。由于TLR3不仅表达于肺上皮细胞,而且也表达于树突细胞和巨噬细胞,故为了确定这种变化的具体细胞的位置,我们采用免疫组化染色进行了分析,结果显示TLR3主要表达于Ⅱ型肺上皮细胞,荷瘤组与对照组野生型小鼠相比肺上皮细胞上的TLR3表达明显升高;而IL-37d明显抑制荷瘤组小鼠肺上皮细胞上TLR3表达的升高。结果说明IL-37d可以通过抑制肿瘤转移早期（1W）II型肺上皮细胞上TLR3的表达,进而抑制中性粒细胞在肺转移前灶中的募集。4.IL-37d对肿瘤转移早期肺内S100a8/9和MMP9表达的影响近年来的研究发现钙防御蛋白S100a8/9在肿瘤转移前灶的形成中发挥重要作用,它们不仅可以增强肿瘤细胞的恶性成度和迁移能力,还可以增强中性粒细胞的迁移能力,并具有趋化因子样作用,可募集更多的中性粒细胞到达转移前灶。我们在上述肺部免疫微环境的动态分析发现肿瘤转移早期-S100a8/9表达明显上调。为了探索IL-37d抑制肿瘤转移早期中性粒细胞在肺内募集的机制,我们采用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法,分别在RNA水平和蛋白水平研究了IL-37d对这些分子的表达的影响,实时荧光定量PCR（QPCR）的结果显示,IL-37d明显抑制肿瘤诱导的S100a8和S100a9RNA转录的升高;免疫组化分析显示IL-37d可明显减少肺内S100a8/9阳性细胞的数量。上述结果说明IL-37d可在肿瘤转移早期抑制S100a8、S100a9的表达。已知S100A8 and S100A9可正向调控MMP9的表达并且MMP9可通过调控多个生理过程和信号通路在肿瘤进展和转移微环境的形成中发挥重要作用,故我们们采用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法,分别在RNA和蛋白水平研究了在肿瘤转移早期（1W）IL-37d对MMM9表达的影响,实时荧光定量PCR（QPCR）的结果显示,IL-37d可明显抑制肿瘤诱导的肺中MMP9转录水平表达的升高;免疫组化分析显示IL-37d可明显减少肿瘤诱导的肺内MMP9阳性细胞的数量,说明IL-37d也可明显抑制肺内MMP9的表达。总之,IL-37d可以通过抑制肿瘤转移早期S100a8/9和MMP9的表达,进而抑制中性粒细胞在肺内的聚集。四、IL-37d对肿瘤诱导的骨髓中性粒细胞自发迁移的影响和机制（一）IL-37d可抑制肿瘤细胞对骨髓中性粒细胞自发性迁移的诱导作用新进的研究显示肿瘤可增强骨髓中中性粒细胞的自发迁移能力,这种作用可能是中性粒细胞在转移前灶募集的机制之一。为了进一步探究IL-37d在肺转移前灶中抑制中性粒细胞募集的机制,我们依然采用了 LLC小鼠肺癌细胞转移瘤模型,通过分离纯化骨髓中的Ly6G+标记的中性粒细胞,通过体外Transwell迁移实验并用流式细胞术,分析在没有趋化因子存在时,已经迁移到Transwell下室中性粒细胞的数量,结果发现肿瘤细胞可明显诱导野生型小鼠中性粒细胞的自发迁移能力,IL-37d转基因小鼠可明显抵抗肿瘤细胞对骨髓中性粒细胞自发性迁移的诱导作用。（二）Rac1抑制剂可部分逆转IL-37d对肿瘤诱导骨髓中性粒细胞自发性迁移的抑制效应目前的研究资料显示关于肿瘤增强骨髓中性粒细胞迁移能力的机制尚不清楚。结合Rac1在促进细胞的迁移中的重要作用和本实验室前期发现IL-37b能抑制Rac1活性而抑制肿瘤细胞的迁移。我们提出Rac1可能在肿瘤诱导的骨髓中性粒细胞的自发迁移中发挥作用的假设。我们先用Rac1特异性抑制剂NSC23766阻断Rac1活性后,再进行迁移实验。结果发现Rac1抑制剂明显抑制了荷瘤组骨髓中性粒细胞自发迁移能力的升高。在荷瘤小鼠中,Rac1抑制剂和IL-37d共同作用的抑制效果更好。这些结果初步提示IL-37d可能通过抑制Rac1通路抑制骨髓中性粒细胞自发迁移能力,但确切机制尚需进一步研究。结论1.IL-37d抑制皮下原发移植瘤的生长,显著增加小鼠的生存率。2.IL-37d抑制肿瘤转移早期肺中中性粒细胞浸润,抑制肺内转移前灶的形成;其机制可能可通过抑制Ⅱ型肺上皮细胞TLR3及肺内S100a8/9和MMP9的表达,进而抑制中性粒细胞在肺内聚集。3.IL-37d抑制骨髓中性粒细胞的自发迁移能力,进而抑制中性粒细胞从骨髓向肺内的迁移;其机制可能通过抑制Rac1通路发挥作用。创新性及意义1.我们首次提出IL-37d通过调节肿瘤微环境来抑制肿瘤生长和转移。2.率先发现并提出IL-37d可通过抑制骨髓中性粒细胞的迁移能力及在肺内的募集,调节转移前肺内的免疫微环境,起到抑制肿瘤转移的作用。3.研究结果揭示肿瘤转移前灶免疫微环境的形成机制以及利用IL-37d抑制肿瘤的转移、控制肿瘤的发展提供了实验依据并奠定了理论基础。局限性由于时间的限制和新冠肺炎疫情的影响,有关IL-37d抑制肿瘤转移早期肺中中性粒细胞募集的作用中,IL-37d发挥作用的位置还需要明确,其机制还需要深入探究。IL-37d通过抑制骨髓中性粒细胞的自发迁移能力其具体的机制尚未完全弄清,尚需进行深入的研究。