基于基因扩展密码子与光点击标记7D12用于食管鳞癌荧光成像

作     者：田振超 

作者单位：西安电子科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈丹

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：纳米抗体 基因扩展密码子 光点击反应 荧光成像 

摘      要：纳米抗体相关的靶向分子探针被广泛地应用于分子成像研究中。这类探针采用随机标记方法引入染料、核素等基团时,会导致标记后产物不均一、对靶标的亲和力低、标记效率低等问题。基因扩展密码子技术能够实现在抗体特定的位点上特异标记非天然氨基酸,从而引入分子探针所需要的发光基团、核素或纳米粒子,避免随机修饰导致的问题。此外,带有烯烃基团的非天然氨基酸能够与四唑类化合物在光激发下发生快速环化的生物正交反应。因此,本研究利用基因扩展密码子技术和光点击反应,实现对纳米抗体的定点特异性荧光标记。本文选择特异性靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的纳米抗体7D12作为研究对象,通过基因扩展密码子的方法,在原核细胞中表达、纯化了第13位或76位引入带有烯烃基团的非天然氨基酸N-ε-丙烯酰赖氨酸的纳米抗体。优化光点击反应条件使得四唑类化合物与纳米抗体发生高效的环加成反应,生成具有荧光基团的纳米抗体。利用合成的纳米抗体荧光探针进行细胞和在体成像实验,以研究其作为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）分子诊断探针的可行性,主要研究结果如下:1、完成原核细胞表达质粒构建:构建表达野生型纳米抗体的重组质粒p ET24a-7D12;构建实验组纳米抗体质粒,即第13位或76位氨基酸密码子突变为UAG的重组质粒p ET24a-7D12-13和p ET24a-7D12-76;构建对照组纳米抗体质粒,在实验组质粒的基础上,对EGFR结合相关的氨基酸密码子进行突变,得到质粒p ET24a-7D12-mut、p ET24a-7D12-13-mut和p ET24a-7D12-76-mut,以上质粒均通过测序验证正确。2、完成纳米抗体表达、纯化和亲和力测定:合成、纯化并鉴定了N-ε-丙烯酰赖氨酸、四唑类化合物T3及交联产物Cy5-T3。在培养基中加入N-ε-丙烯酰赖氨酸,诱导含有上述质粒的原核细胞表达抗体蛋白;通过离子亲和层析,凝胶过滤层析对蛋白质进行纯化,得到纯度大于90%的7D12野生型以及7D12-13-AcrK、7D12-13-AcrK-mut突变体蛋白。通过间接酶联免疫吸附法测定上述蛋白与EGFR的亲和力,结果表明在纳米抗体7D12中定点插入N-ε-丙烯酰赖氨酸不影响抗体与EGFR的结合力。3、通过光点击反应得到荧光标记的纳米抗体:在含有化合物T3的HEPES溶液中,通过365 nm紫外光激发2小时完成抗体7D12-13-AcrK与7D12-13-AcrK-mut的荧光标记,SDS-PAGE胶上检测表明上述蛋白条带具有荧光。光谱测定结果显示,点击产物有380 nm的紫外吸收以及520～540 nm的荧光发射。4、实现食管鳞癌细胞系ECa109及其荷瘤鼠模型体外、体内荧光成像:体外成像结果显示,浓度为12.5 n M的7D12-13-AcrK-T3探针即可实现对ECa109细胞的荧光成像,对照组与EGFR阴性细胞均未检测到荧光信号。在体成像结果表明,7D12-13-AcrK-T3探针可以快速、准确地靶向肿瘤,主动靶向组肿瘤信号在注射后3 h即达到峰值,6 h即恢复注射前水平。其肿瘤与背景比（tumor to background ratio,TBR）最高为1.16（±0.02）,是非靶向组的2.8倍,离体的脏器、肿瘤结果与在体一致。利用探针7D12-13-AcrK-T3-Cy5进行成像的结果显示,肿瘤信号在24 h达到峰值,TBR为0.88（±0.01）。本研究优化了纳米抗体分子探针的标记流程,为合成高亲和力、高特异性和快速靶向的分子探针,以及为实现高效的食管鳞癌分子成像提供了新的思路和手段。