基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响及分子机制初探

作     者：田博仁 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋关斌

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：聚丙烯酰胺水凝胶 基质刚度 肿瘤干细胞 肝癌 Integrin-β1 

摘      要：癌症是严重危害人类生命的恶性疾病,每年导致的死亡人数仅次于心脑血管疾病。肝癌恶性程度高,预后差,致死率高。在中国,肝癌的发病率和死亡率远远高于世界平均水平。肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）是肝癌细胞中数量极少的一群细胞,具有自我更新能力和转移潜能,对药物和放射治疗不敏感,在肝癌的转移和复发中起关键作用。研究表明,癌干细胞（Cancer stem cells,CSCs）具有表型可塑性,即癌细胞可以在一定条件下转换为CSCs,而CSCs也可以分化为癌细胞。这两者表型之间如何转换,在什么条件下相互转换?目前的研究仍存在争议。以往的研究表明力学因素能够影响干细胞的分化,例如不同的基质刚度能够诱导间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）分化为不同类型的细胞。由于癌干细胞和正常干细胞具有类似性,研究者们也发现了力学因素能够诱导CSCs分化为癌细胞或者诱导癌细胞向CSCs方向逆转化。例如流体剪切力可以诱导LCSCs分化为肝癌细胞,流体剪切力可以诱导肺癌细胞获得癌干细胞表型。这些结果都表明力学因素能够引起癌细胞/CSCs表型的变化。肝癌组织具有力学异质性,即肝癌组织的基质刚度分布并不是均一性的。在一个肿瘤组织中,肿瘤组织边缘和内部位置的基质刚度具有明显的差异,同时CSCs在一个组织内部的分布也是不均匀的。此外,肝纤维或肝硬化引起的肝基质刚度增加往往会引起肝脏组织癌变,肝癌组织的刚度远远高于正常肝组织。两方面的原因都提示肝癌的发生发展与基质刚度有直接联系。而在这其中基质刚度是否能够影响肝癌细胞的癌干细胞表型,目前的研究报道仍很少。整合素β1（Integrin-β1）是一种跨膜蛋白,在以往的研究中被认为是一种力敏感分子,能够调节细胞的迁移、增殖、粘附能力等。Integrin-β1在近年来的研究中被发现在癌症的发生发展中起到了重要的作用。同时也有部分文献显示Integrin-β1能够调控癌细胞的癌干细胞表型。基于此,本文考察了基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响,对其中的分子机制进行了探索。主要的研究内容和结果如下:（1）不同刚度基质细胞培养模型的构建本文采用聚丙稀酰胺（Polyacrylamide,PA）水凝胶构建实验模型。通过调节配方中丙烯酰胺（Acrylamide）和双丙烯酰胺（Bis-acrylamide,Bis）的配比来构建不同刚度的水凝胶。本文构建的聚丙烯酰胺水凝胶的刚度可控,能够模拟正常肝脏（5.9 kPa）或病变肝脏（24.8 kPa、48.1 kPa）的基质刚度。在刚度可控的同时为细胞提供良好的生长界面。为研究肝脏病变力学机制提供了一个新的体外研究平台。（2）基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响为探究基质刚度能否影响肝癌细胞癌干细胞表型,本文通过形态学、细胞骨架、干细胞相关基因、肝癌干细胞表面标志分子、侧群细胞（Side population cells,SP）、细胞周期、成球能力、克隆形成能力、耐药性、裸鼠成瘤能力等多个方面来综合考察癌干细胞表型是否发生变化。结果发现,5.9 kPa的基质刚度能够使细胞铺展减少、骨架聚合减少,增加细胞的癌干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、CXCR4的表达和肝癌干细胞表面标志分子CD133和CD90阳性细胞数量,聚集更多的SP细胞。细胞在5.9 kPa的基质上具有更缓慢的细胞周期、更强的成球能力和克隆形成能力。5.9 kPa的基质刚度能够使细胞在药物索拉菲尼和5-氟尿嘧啶的处理下保持较强的克隆形成能力。最后研究从动物模型上证明了在5.9 kPa基质刚度上培养的肝癌细胞具有更强的致瘤能力。实验结果表明,较软的（5.9 kPa）基质刚度能够诱导肝癌细胞MHCC97H的癌干细胞表型的增加。（3）基质刚度诱导肝癌细胞癌干细胞表型的机制本文通过检测发现随着基质刚度的增加Integrin-β1的表达逐渐降低,提示到Integrin-β1可能与癌干细胞表型的变化有联系。实验通过siRNA干扰技术成功敲减Integrin-β1的表达,干扰了Integrin-β1的表达之后,5.9 kPa的基质刚度增加干细胞相关基因表达和肝癌干细胞表面标志物阳性数量增高的现象受到了抑制。实验结果提示,较软的（5.9 kPa）基质刚度可能是通过介导Integrin-β1的表达增加上调肝癌干细胞标志物CD90、CD133的表达。本文的结果表明,较软的（5.9 kPa）基质刚度能够诱导肝癌细胞的癌干细胞表型的增加,其中可能是通过介导Integrin-β1表达的增加上调肝癌干细胞标志物CD90、CD133的表达。