白菜WRKY基因家族进化分析及花粉发育相关基因BcWRKY31的表达与功能鉴定

作     者：马生辉 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹家树;蒋晶晶

授予年度：2018年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：白菜 WRKY 进化 花粉发育 功能 

摘      要：WRKY转录因子家族是植物转录因子家族中最重要的家族之一,其成员广泛参与植物生长发育的各个环节。作为转录水平上重要的调控因子,WRKY参与众多生长发育相关基因上游的激活子或者抑制子的复杂调控响应网络。通过研究WRKY转录因子的功能,我们可以更深入地理解基因间错综复杂的调控网络及其背后的调控机制。一方面,随着全基因组测序时代的到来,越来越多物种的基因数据库被建立起来,有关WRKY基因家族的分类、结构特征和进化特征的报道也越来越多,为我们了解WRKY家族的起源和进化提供了方便;另一方面,越来越多的研究表明许多WRKY转录因子都会参与植物响应外界环境胁迫的调控途径,并且在这些途径中发挥重要作用。WRKY转录因子的功能不仅表现在胁迫响应的过程中,也参与到植物的生殖生长过程中,如:At WRKY18会影响花粉的形态发育;At WRKY34参与了花粉在冷害胁迫下的响应等。本研究利用拟南芥电子表达谱找出了在拟南芥花粉发育过程中特异表达的几个WRKY基因,并通过同源关系找到了这些基因在白菜中的同源基因。通过实验,我们发现At WRKY31在白菜中的同源基因BcWRKY31在花粉中特异表达并且在白菜中存在唯一转录本。本实验通过WRKY基因家族的进化分析、突变体分析以及过表达分析,探索BcWRKY31在白菜花粉发育中发挥的作用。获得的主要结果和结论如下:（1）通过基因家族的进化分析,明确了白菜WRKY基因家族的进化特征。本研究共发现了白菜WRKY基因家族的成员138个,它们在进化过程中都经历了全基因组的多倍化事件和芸薹属特有的基因组三倍化复制,与其他物种的WRKY转录因子一样,白菜WRKY转录因子也可以分为家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,且家族Ⅱ分为五个亚家族（Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe）。（2）在进化过程中,白菜WRKY基因家族基因的损失率较低。通过对白菜WRKY基因家族以及拟南芥WRKY基因家族的系统发生分析以及共线性分析可知,在经历了全基因组复制事件及基因组三倍化后基因的数量发生了很大的变化。通过对其WRKY基因损失率的计算,发现其基因的损失率远远小于白菜保守基因的平均损失率（60%）,这说明在经历两次复制事件后大部分新增的WRKY基因都到了保留。（3）拟南芥花粉发育相关WRKY基因之间可能存在功能互补。通过对拟南芥突变体wrky31的花粉进行染色观察,发现花粉活力正常,与野生型花粉无明显差异。随后对At WRKY31以及其他几个花粉发育相关WRKY基因的定量分析,发现在At WRKY31表达量被抑制的同时,其他几个WRKY基因的表达量都有所上调,故推测可能是上调的WRKY基因弥补了At WRKY31功能上的缺陷。（4）BcWRKY31的启动子在成熟花粉中特异表达,且过表达BcWRKY31可以导致白菜成熟花粉粒的形态发育异常。扩增BcWRKY31的启动子构建了启动子表达分析载体,对拟南芥遗传转化后进行GUS染色分析,结果显示BcWRKY31的启动子在成熟花粉中具有特异启动活性。构建BcWRKY31过表达载体,经遗传转化获得过表达BcWRKY31的转基因植株。对转基因植株进行形态学和细胞学的观察,结果显示过表达植株在营养生长阶段与对照植株无明显差别,并且花器官的形态发育未见异常。分别用亚历山大、荧光增白剂和DAPI对过表达植株花粉进行染色观察,结果表明花粉活力、花粉萌发沟的发育及花粉内细胞核均与对照组无明显差异;利用扫描电镜对过表达植株的花粉形态进行观察,发现大约70%花粉的形态出现异常。以上结果表明BcWRKY31参与白菜花粉发育过程,影响花粉粒的形态发育。