碱性蛋白酶的固定化及其制备抗骨质疏松鱼皮胶原活性肽的研究

作     者：叶芊芊 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖凯军;王志刚

授予年度：2020年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：鱼皮胶原多肽 碱性蛋白酶 固定化酶 抗骨质疏松活性 

摘      要：鱼皮胶原多肽是以鱼皮为原料,经过蛋白酶水解工艺制备的小分子肽类物质,具有多种生理活性功能。本文选用枯草杆菌碱性蛋白酶（Bacillus Subtilis Alkaline Protease,BAP）水解罗非鱼皮胶原蛋白,分别制备了BAP交联酶聚集体（BAPcrosslinked enzyme aggregates,BAP-CLEAs）,高分子膜载体固定化BAP和天然生物蛋壳膜（Eggshell membrane,ESM）载体固定化BAP（ESM-BAP）,对比此三种固定化酶酶解鱼皮胶原蛋白多肽的酶解效率,选择ESM-BAP进行后续鱼皮胶原多肽的制备。用超滤膜进行抗骨质疏松鱼皮胶原活性肽的分离,通过体外成骨分化诱导细胞实验和斑马鱼的骨质疏松活性实验,筛选最适分子量范围的抗骨质疏松鱼皮胶原活性肽。本论文的主要研究内容和结果如下:（1）无载体自交联法制备BAP-CLEAs的研究。利用交联剂京尼平成功制备了BAP-CLEAs,在交联温度为35℃,交联剂浓度为0.50%,交联时间为12 h时,BAP-CLEAs获得最大酶活回收率为55.04%;通过SEM、FTIR和酶学性能的表征,证明京尼平成功实现对BAP的交联,形成BAP-CLEAs,游离酶和BAPCLEAs的最适催化温度均为45℃,BAP-CLEAs的最适催化p H比游离酶提高了1.0,其酸碱稳定性和热稳定性均高于游离酶;BAP-CLEAs对底物的亲和力降低,重复使用稳定性增强,重复使用5次后仍保留了86.42%的相对酶活性。（2）高分子膜载体固定化BAP的研究。以醋酸纤维素（Cellulose acetate,CA）膜为载体,并进行固定化酶制备条件的优化。在交联剂戊二醛浓度为2.5%,交联温度为35℃,酶浓度为8 mg/m L,交联时间为2 h的条件下制备的CA膜固定化酶（CA-BAP）的酶活回收率达最大值57.08%;固定化酶的SEM、FTIR和酶学特性的研究结果表明,酶分子被成功固定化在CA膜上,形成CA-BAP,其最适催化p H向碱性偏移,最适催化温度升高至55℃,且酸碱稳定性和热稳定性均优于游离酶;酶动力学结果表明,CA-BAP对底物的亲和力降低,重复使用稳定性提高,重复使用5次后仍保留了93.20%的相对酶活性。（3）天然生物材料蛋壳膜固定化BAP（ESM-BAP）的研究。利用ESM对酶进行固定化,选择京尼平作为交联剂进行进一步的制备条件优化,在京尼平浓度为0.75%,交联温度为45℃,酶浓度为5 mg/m L,交联时间为2 h时,ESM-BAP的酶活回收率高达64.87%;通过SEM、FTIR证明了BAP成功被固定在ESM上;ESM-BAP的酶学性能结果表明,ESM-BAP的最适催化p H与游离酶相同,最适催化温度升高至55℃,且酸碱稳定性和热稳定性均在一定程度上优于游离酶;ESM-BAP对底物的亲和力和催化效率变化不大,可提高酶的重复使用性,重复使用5次后仍保留了89.14%的相对酶活性。（4）抗骨质疏松鱼皮胶原多肽的制备及其活性研究。比较BAP-CLEAs、CA-BAP、ESM-BAP的酶解效率,结果表明ESM-BAP的酶解效率最高;将ESM-BAP应用于抗骨质疏松鱼皮胶原多肽的制备,利用超滤膜对水解液进行超滤处理,得到分子量范围分别为3 k Da～5 k Da（P5）,1 k Da～3 k Da（P3）和1k Da（P1）的罗非鱼皮胶原多肽;三种不同分子量鱼皮胶原多肽的成骨细胞分化诱导实验证实了鱼皮胶原多肽的抗骨质疏松活性,选择了效果较好的P1和P3进行后续的斑马鱼体内实验;通过斑马鱼体内实验表明,P1和P3样品组均拥有对斑马鱼骨形成抑制的恢复作用,即具有抗骨质疏松活性,且P1样品组抗骨质疏松活性优于P3样品组。