赖氨酸脱羧酶一步纯化-固定及分子修饰研究

作     者：杜岩 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张雷

授予年度：2019年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：1,5-戊二胺 一步纯化-固定 酶分子修饰 分子模拟 

摘      要：1,5-戊二胺具有重要的工业应用价值,可用于合成药物,螯合剂,添加剂等等,其中最重要的应用就是合成聚酰胺（尼龙）。聚酰胺在全球具有巨大的市场,年消耗量约为660万吨。由1,5-戊二胺合成的生物基尼龙PA56性能优越,可以替代传统尼龙,缓解因传统尼龙生产而带来的环境污染、资源枯竭等诸多问题。生物法在1,5-戊二胺生产中具有重要的地位,其中赖氨酸脱羧酶是生物法合成1,5-戊二胺的关键酶。但是,赖氨酸脱羧酶稳定性较差,容易失活变性,这一缺陷限制了1,5-戊二胺的高效生产。为了解决这一问题,本文针对赖氨酸脱羧酶进行了多方面的研究。首先,在大肠杆菌中过表达带有6*His标签的赖氨酸脱羧酶,利用性质稳定的海藻酸钡水凝胶微球作为无螯合配体的固定化金属离子亲和层析（IMAC）固相介质,对重组的赖氨酸脱羧酶进行一步纯化-固定,并对固定后的赖氨酸脱羧酶进行了酶学性质和动力学参数的测定。结果显示,此种策略对于重组赖氨酸脱羧酶的纯化具有较高的特异性,制备的固定化赖氨酸脱羧酶p H稳定性得到增强。在p H=8条件下,固定化赖氨酸脱羧酶保留了60%的相对活性,而游离酶仅保留有40%相对活性。此外,相较于游离酶,固定化酶对于底物L-赖氨酸的亲和性更高。之后,采用了生物法对赖氨酸脱羧酶进行改造:在该酶的C端连接一段20个氨基酸长度的EK多肽（交替排列的赖氨酸-谷氨酸多肽）。在形成高级结构十聚体之后,相当于在酶的外围接枝了一圈“两性离子聚合物。蛋白外围的超亲水结构能够为赖氨酸脱羧酶提供良好的亲水微环境,吸收蛋白内部的多余水分子,增强蛋白中心疏水相互作用,大幅提升蛋白的稳定性。经过修饰之后的赖氨酸脱羧酶,催化活性提高为野生型酶的2倍,在极端条件下（如p H=8或65℃条件下）的活性仍比野生型酶在最适条件下的活性更高;对于酸碱、有机溶剂和变性剂的耐受性也得到了很大程度提升,在不同p H缓冲液、变性剂及有机溶剂中储存一定时间后,残留活力为游离酶活性的2-7.4倍;在4℃条件下储存21天后,可保留约50%的活性,而野生型酶则全部失活。此外,修饰后的赖氨酸脱羧酶能够降低底物对于酶活性的抑制作用,在高浓度L-赖氨酸条件下产生更多的1,5-戊二胺。通过在线分析工具预测了修饰型酶的理化性质;借助Amber18软件对赖氨酸脱羧酶和底物进行了对接分析（Docking）,预测了酶的催化机理;通过分子动力学模拟,分析了蛋白的RMSD、结合能、催化距离等等,提出“拥抱-握手模型,对赖氨酸脱羧酶酶学性能提升做出了合理解释。通过连接EK肽段的方法对赖氨酸脱羧酶进行修饰,在提升酶催化活性的同时增强了酶的稳定性,为改造1,5-戊二胺合成代谢途径以及构建1,5-戊二胺高产菌株打下了良好的基础。