祖师麻注射液的质量评价研究

作     者：孙岩 

作者单位：北京工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄胜阳

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：祖师麻注射液 质量评价 高效液相指纹图谱 类过敏反应 实时细胞电子分析技术 模式识别 

摘      要：中药注射液的质量控制是中药现代化面临的核心问题之一。质量可控是中药注射剂安全有效的基础和保障,科学合理的质量标准是药品质量保证体系的重要组成部分。本论文以单味制剂祖师麻注射液为研究对象,将现代仪器分析与化学计量学相结合,从化学和生物学角度建立一种综合的中药注射剂质量评价方法。本论文的主要研究内容如下:1、首先建立祖师麻注射液的HPLC指纹图谱和化学模式识别模型,为评价祖师麻注射液的质量一致性提供参考。采用Agilent C色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相A(0.1%甲酸水)-B(乙腈),梯度洗脱0～10 min 95%～90%(A);10～28 min,90%～87%(A);28～40 min,87%～86%(A);40～50 min,86%～70%(A);50～55 min,70%～60%(A);流速1.0 m L·min;检测波长0～30 min,300 nm;30～35 min,254 nm;35～55 min,300 nm;柱温30℃;进样体积10μL。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)考察15批祖师麻注射液的相似度,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚类分析(cluster analysis,CA)以及正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)对祖师麻注射液进行整体质量评价。结果显示,祖师麻注射液的HPLC指纹图谱中15批样品相似度在0.882～0.998,通过PCA、CA、OPLS-DA分析,15批样品聚成3类,S1～S8来自同一厂家,聚为2类;S9～S14来自同一厂家聚为1类,并从12个共有峰中确定4个共有峰为祖师麻注射液质量标志物(Q-marker),分别为5、8、7(祖师麻甲素)、1号峰。建议厂家在生产过程中对这4个标志物进行重点关注。本研究同时对其高温组样品、光照组样品、暴露组样品分别进行了化学指纹图谱检测,对四组祖师麻注射液进行聚类分析,可知暴露对样品稳定性的影响较大。建议在运输和贮藏过程中保持药品的密封性,使用前现用现配。该方法简便,重现性好,可快速评定不同厂家不同批次祖师麻注射液的稳定性和一致性,适用于对祖师麻注射液整体质量的评价。2、建立一种新的体外类过敏反应检测模型,快速评价不同厂家不同批次祖师麻注射液的临床前安全性。选择嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞作为体外检测类过敏反应的细胞模型,选择Compound 48/80作为阳性致敏药物,同时利用甲苯胺蓝染色法观察Compound 48/80作用细胞后形态、骨架的变化,验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。并采用CCK-8法测定RBL-2H3细胞的合适接种密度和祖师麻注射液的细胞毒性。利用实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)系统检测药物干预后引起的细胞指数(cell index,CI)值变化,得到药物对应的细胞指纹图谱。同时采用聚类方法(CA)对15批祖师麻注射液对应的细胞指纹图谱进行统计分析。本研究同时对不产生类过敏样反应的样品(S9～S15)对其进行高温、光照、暴露处理,对其分别进行细胞指纹图谱检测和聚类分析。结果显示,CCK-8法测定RBL-2H3细胞的合适接种密度为1.0×10/m L;CCK-8法确定祖师麻注射液合适的给药浓度为5:95(药物体积:培养基体积);Compound 48/80(20μg/m L)使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象,且在细胞指纹图谱中呈现30 min内快速下降,之后下降趋势变缓,与空白对照形成鲜明的对比,提示RTCA系统可以快速敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒作用。15批祖师麻注射液的细胞指纹图谱结合聚类分析(CA),结果发现不同厂家的祖师麻注射液对RBL-2H3细胞影响不同,S1～S8与Compound48/80组聚为一类,提示该样品可能潜在临床类过敏反应;S9～S15与空白对照组聚为一类,提示该样品无类过敏样反应。从高温组样品、光照组样品、暴露组样品的检测结果中可知暴露组对样品安全性的影响较大,产生了较明显的类过敏反应趋势,这与化学指纹图谱检测结果一致。本研究建立了一套基于RTCA系统结合模式识别的类过敏反应体外快速评价技术,可用于中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。