围产期奶牛脂肪肝疾病诊断的代谢标记物筛选

作     者：张璇 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：师科荣

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：奶牛 围产期 脂肪肝 代谢组 生物标记物 诊断标记 

摘      要：脂肪肝是奶牛围产期易发的一种代谢紊乱性疾病,导致减产且影响奶牛后续的繁殖性能而导致产后的高淘汰率,给乳品行业造成了巨大的经济损失。由于奶牛个体较大,B超等辅助诊断手段都不准确。唯一可靠的诊断方法是肝活检。但是肝脏活检加倍损害牛的健康,并对产奶量产生不利影响。当然,生产实践中人们也借助血清生化指标(如AST、ALT、GLU等)来辅助诊断发病的奶牛,但同样存在较大误差。因此,奶牛生产中亟需开发可靠、经济、实用且无害的诊断方法。为此,我们拟利用奶牛的代谢物粪、尿液和血清进行可能的诊断标记物筛选。首先对18头荷斯坦奶牛进行围产期肝活检,诊断为正常组(脂肪含量13.17%±8.20%,n=8)和脂肪肝病组(脂肪含量84.71%±4.83%,n=10),命名为“发现集;选择一天晨饲前空腹采集其血液,尿液,粪便样品,进行GC-TOF/MS检测,数据经Xplore MET平台和SPSS软件处理,检测数据经多维V-plot火山图和单维T检验筛选,得到潜在生物标记物。同时进行血清传统生化指标检测,作为后续生物标记物诊断能力检测的对照。继而选用20头生化指标、B超等兽医诊断结果与上述发现集群体中诊断正常和(或)病牛相似的奶牛,分为疑似正常组(n=10)和疑似病组(n=10),称为“验证集,同样空腹采集血液,尿液,粪便,验证集采用同样的方法进行二轮筛选,将筛到的标记物与发现集所得到的潜在生物标记物取交集,得到最终的生物标记物,以此进行验证。质量控制和主成分分析表明,患病组和正常组的分组情况是成功的,根据OPLS-DA分析,患病组与正常组有显著性差异。在发现集中识别出患病组和正常组中表达的候选标记。小提琴地图和ROC曲线初步验证了潜在的生物标志物的存在。这些候选差异标记也通过验证集进行了验证。发现集中,经筛选得到潜在生物标记物粪便中23个,尿液中7个血液中24个,经与验证集筛选得到的标记物取交集后,终得到生物标记物粪便中两个:L-α-氨基丁酸,山嵛酸;在尿液中1个:3-硝基酪氨酸;在血液中,保留了7个:L-天冬酰胺,棕榈油酸,L-丝氨酸,硬脂酸,十九烷酸,岩芹酸,十七烷酸。得到的生物标记物,经过上述的独立样本集验证集验证后,又继续进行方法验证,采用了ROC曲线对生物标记物和传统生化指标的诊断能力进行了检测,证实了生物标记物比传统血清生化指标(AST、GLU等)具有极显著的诊断准确性。此外,我们的血清、粪、尿代谢组学分析表明,与正常奶牛相比,发生脂肪肝的奶牛其胆汁酸、氨基酸、脂类等生物学过程均存在异常代谢调节。众所周知,这些过程都与脂肪代谢紊乱和脂肪沉积密切相关,因而这些异常的代谢调节过程可能是奶牛脂肪肝发病的内在因素。值得一提的是,本研究鉴定获得的生物标记物与这些代谢途径显著相关,这为我们研究奶牛脂肪肝的发病机制提供了一个前瞻性的理论指导。总之,所鉴定的粪便、尿液、血液生物标记物被确认为诊断奶牛脂肪肝的新型有效标记物。生物标志物的诊断效果明显优于传统的血清生化指标。而且,新型诊断标记物对围产期脂肪肝病奶牛的诊断和检测具有经济、方便、快捷以及动物福利保护等的潜在重要意义,将为提高奶牛产量和生产效率发挥潜在的重要价值