橡胶树HbHMGS1基因启动子的克隆与功能分析

作     者：巩笑笑 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘进平

授予年度：2019年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：橡胶树 羟甲基戊二酰辅酶A合酶1(HMGS1) 启动子分析 GUS染色 功能分析 

摘      要：羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）是橡胶树（Hevea brasiliensis）中天然橡胶生物合成过程的一个重要的酶。但是,关于HMGS基因的调控表达方面的研究报道不是很多。本研究克隆了橡胶树HHMGS1基因上游长1656 bp的启动子序列,并利用启动子预测软件PLACE和PlantCARE对其进行分析。然后以GUS基因作为报告基因,构建HbHMGS1启动子序列和系列5’缺失片段表达载体（Ll-1656、L2-1290、L3-1040、L4-699、L5-454及L6-213）并通过农杆菌介导的方法转化到烟草和拟南芥中,定性和定量检测其响应激素和非生物胁迫下的GUS蛋白表达活性。结果如下:***1启动子序列生物信息学分析结果表明:该启动子含有真核生物启动子基本元件TATA-box和CAAT-box及多种调控元件,如光响应相关元件（AT1-motif、Box4、GT1CONSENSUS、GATABOX和SORLIPs等）;激素响应元件（乙烯、赤霉素、茉莉酸及脱落酸等）;非生物胁迫相关响应元件（热胁迫、干旱、创伤及冷胁迫等）及其它多个重要作用元件。2.烟草叶片瞬时表达分析结果表明,除了 L6-213缺失启动子外,Ll-1656、L2-1290、L3-1040、L4-699及L5-454缺失启动子均能够启动GUS基因的表达,且叶片染色呈显明显的蓝色,表明除L6-213缺失之外的HbHMGS1启动子序列具有启动活性。3.T2代拟南芥转基因植株GUS化学染色结果表明,在转基因拟南芥幼苗及成熟期不同组织器官中,Ll-1656、L2-1290、L3-1040、L4-699及L5-454缺失启动子都能够启动GUS蛋白的表达,且GUS染色呈显明显的蓝色,但是缺失片段L6-213 GUS染色未见蓝色,这与烟草瞬时表达结果相一致。GUS定量活性检测结果发现:缺失启动子 L2-1290、L3-1040 GUS 活性要比L1-1656、L4-699 及 35S 启动子高,且 L5-454 GUS 活性最高,分别是 CaMV35S、L1-1656、L2-1290、L3-1040 及L4-699活性的2.19、2.39、1.50、1.51及2.53倍,活性最低的是L6-213缺失启动子。这些数据表明-1290到-699及-213到-454区域可能存在重要作用元件或增强子元件以增强HbHMGS1启动子的表达活性。4.三种激素（乙烯利、茉莉酸甲酯及赤霉素）的系列浓度梯度溶液处理包含有HbHMGS1启动子（L1-1656）的转基因拟南芥苗表明:各激素处理浓度分别为0.08%、0.2%及50 μM时GUS活性较高;且每种处理在不同时间点取样,GUS活性也不同。将包含Ll-1656启动子的T2代转基因拟南芥植株进行光照和黑暗处理发现:光照条件下GUS蛋白活性在处理96小时后增大到处理72 h的3.2倍,黑暗条件下处理72及96 h后GUS活性也明显增加,且分别是处理48 h时GUS活性的1.38和2.13倍。该实验表明,HbHMGS1启动子在调控HbHMGS1基因响应激素和光照表达方面起到重要作用。5.在转基因拟南芥中研究HbHMGS1启动子的昼夜节律变化表明:橡胶树HbHMGS1启动子在昼夜间的表达活性表现不一致。无论是在长日照（16 h光照/8 h黑暗）还是短日照（8h光照/16h黑暗）生长条件下,相对较高的GUS活性都出现在光照结束后（黑暗中）;且在短日照条件黑暗时最高GUS活性是长日照条件黑暗时最高GUS活性的1.57倍。6.通过定量检测HbHMGS1启动子及其各缺失启动子响应0.04%乙烯利、0.1%茉莉酸甲酯、100 赤霉素、37℃热击、4℃低温及干旱处理的GUS蛋白活性发现,乙烯利和赤霉素的主要响应区域都是-699到-454的245 bp;-1656到-1290的366 bp则是茉莉酸甲酯响应的主要区域;-699到起始密码子-1处的699 bp序列可能是主要的热击响应区域;干旱响应区域则主要位于-213到起始密码子-l处的213 bp序列中;同理,-1656到-1290的366 bp及-699到-454的245 bp是低温响应区域。实验表明,HbHMGS1启动子在调控HbHMGS1基因响应以上三种激素（乙烯利、MeJA及GA）和以上三种非生物胁迫处理（热击、低温及干旱）的诱导表达方面起重要作用。