利用全局转录调控工程提高酿酒酵母异丁醇耐受性的研究

作     者：温智慧 

作者单位：河北工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张爱利

授予年度：2019年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：酿酒酵母 异丁醇 全局转录工程 异丁醇耐受性 缬氨酸代谢通路优化 

摘      要：长期以来,人类对能源的需求不断增大,以微生物为细胞工厂通过发酵法生产醇类生物燃料受到世界各国科学家的广泛关注。异丁醇是公认的第二代醇类生物燃料之一,利用酿酒酵母合成异丁醇具有较高的市场价值和广阔的应用前景。然而,在发酵过程中,酿酒酵母细胞容易受到高温、高渗的影响,且异丁醇对酵母细胞有毒性,直接影响异丁醇产量的提高。因此,增强酿酒酵母对异丁醇的耐受性并优化细胞产异丁醇的能力,具有重要意义。本工作利用全局转录工程(g TME)技术,选育异丁醇耐受性高的酿酒酵母菌株。首先,利用易错PCR技术构建了大小约为4×10的spt15突变文库,将得到的带有spt15突变基因的质粒转入酿酒酵母W303-1A中,得到约5×10个转化子。把随机挑取的转化子在含有4 g/L-8 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC选择培养基上初筛,并通过稀释实验(Dilution)将得到的55株菌分别在省缺色氨酸的SC选择培养基和含有12 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC选择培养基上测定生长情况,筛选得到突变株spt15-3和突变株spt15-43。提取上述两个突变株中的质粒YCplac22-spt15-3和YCplac22-spt15-43后重新转化到野生菌株W303-1A中,再次确认突变株的异丁醇耐受性。结果表明,带有YCplac22-spt15-3的菌株(命名为突变株spt15-3)在含有12 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC平板上生长良好且能在含有16 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC平板上生长。而带有YCplac22-spt15-43的菌株(命名为突变株spt15-43)在含有12 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC平板上的生长情况与野生型菌株无明显差异,都明显低于突变株spt15-3的生长,且在含有16 g/L异丁醇并省缺色氨酸的SC平板上不生长。我们通过测序确定了质粒YCplac22-spt15-3和YCplac22-spt15-43上SPT15基因的突变情况。结果显示,质粒YCplac22-spt15-3中SPT15基因的启动子上存在2个突变位点,编码区内存在1个突变位点,YCplac22-spt15-43中SPT15基因的编码区内存在1个突变位点。最后我们通过存活率实验进一步验证突变株spt15-3的异丁醇耐受性。结果表明,突变株spt15-3在20 g/L异丁醇压力下的存活率是对照菌株(即带有质粒YCplac22的W303-1A的2倍多,是带有质粒YCplac22-SPT15菌株(即Control-1)的1.3倍多,且突变株spt15-3的异丁醇致死剂量为24 g/L。我们通过发酵检测spt15-3突变株的发酵性能。首先,优化了酿酒酵母细胞的缬氨酸代谢途径,在酿酒酵母菌株中过表达缬氨酸代谢途径中的乙酰乳酸合酶基因ILV2,二羟基异戊酸脱水酶的基因ILV3以及编码酮异戊酸脱羧酶的基因ARO10。结果表明,Nor-2的异丁醇产量与对照菌株Ctrl-1相比提高了3.06倍。其次,优化酿酒酵母微厌氧发酵条件,将发酵初始OD值由0.5增加为3.5,初始葡萄糖浓度由25 g/L提高至65 g/L,发酵结果显示,细胞的生长速率和耗糖速率加快,细胞浓度增大。Nor-3、Engi-4和Engi-5的异丁醇产量分别达到0.52 g/L、0.45 g/L和0.42 g/L,与含空载体的Ctrl-1对照菌相比分别提高了7.53、6.45和6.00倍;产率于28 h达到最高,分别为8.36 mg/g葡萄糖、7.29 mg/g葡萄糖和6.78 mg/g葡萄糖,分别是该时刻菌株Ctrl-1产率的9.5倍、8.3倍和7.7倍。在高细胞接种量和高初始葡萄糖浓度的发酵条件下(OD为3.5,葡萄糖浓度为65 g/L),菌株Ctrl-1,Nor-2,Nor-3的异丁醇产率均随发酵时间不断降低,而Engi-4和Engi-5的异丁醇产率在发酵过程中保持分别7.15mg/g葡萄糖和6.48 mg/g葡萄糖。此外,本工作分别研究了过表达脂肪酸去饱和酶编码基因OLE1、过表达细胞壁合成相关蛋白编码基因CWP2、以及过表达水通道蛋白编码基因AQY1对细胞异丁醇耐受性的影响。首先,构建了质粒YEplac181-PGK1p-OLE1,YEplac195-CWP2和YEplac181-PGK1p-AQY1。并将上述质粒转化到酿酒酵母细胞W303-1A中,得到了菌株W303-1A-OLE1,W303-1A-CWP2和W303-1A-AQY1。并确定了菌株W303-1A-OLE1,W303-1A-CWP2和W303-1A-AQY1的异丁醇耐受性。