靶向CD22 CAR的优化以及CAR-T细胞内Ca2+信号活化水平的探究

作     者：钱丽玲 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙洁

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：免疫疗法 嵌合抗原受体T细胞疗法 荧光能量共振转移 CD19 CD22 

摘      要：嵌合抗原受体 T 细胞(Chimeric antigen receptor-T cell,CAR-T)疗法作为一种新型靶向肿瘤的细胞免疫疗法,近20多年来,通过研究者们不断地优化改良及临床前试验,在2017年两款CAR-T产品KYMRIAH和YESCARTA被美国FDA相继批准上市,这两种药物分别被用于治疗B淋巴细胞白血病和淋巴瘤。虽然这两种药物在临床上取得了很好的疗效,但是仍然存在许多副反应,比如细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome,CRS)、B细胞功能缺失、神经毒性、脱靶和复发等,严重时会危及患者生命。除此之外,CAR-T免疫疗法在实体瘤中依然进展缓慢,因此,CAR-T疗法在肿瘤免疫治疗的应用上仍然有待优化。本课题主要是从优化CAR的结构方面着手,探究不同结构的CAR引起的CAR-T细胞在功能上的差异。经过体外实验证实在单独靶向CD22抗原的CAR结构上进行改造,发现通过改变单链可变区(Single chain variable fragment,scFv)上的重链可变区(Variable region of heavy chain,VH)和轻链可变区(Variable region of light chain,VL)的序列和顺序,以及改变胞内信号转导区的CD3ζ免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的数量和位置,会影响CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。除此之外,本文尝试利用荧光能量共振转移(Forster resonance energy transfer,FRET)技术探究这些不同的CAR-T细胞之间的信号活化水平与功能的相关性。最后,结合上述实验结果设计靶向CD19/CD22的双靶标特异性的CAR,找到杀伤效果优良的双靶标特异性CAR。此体外研究成功地筛选出了优化的CD22 CAR,为下一步的CAR在老鼠模型里的抗癌效果的验证和在病人中的临床转化研究打下了良好的基础。