AcMYB1调控洋葱花青苷合成的分子机理研究

作     者：曹琳娇 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马长生

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：洋葱 AcMYB1 花青苷 酵母杂交 荧火素酶互补实验 启动子 

摘      要：洋葱（Allium cepaL.）是极具食用价值的园艺作物,是百合科葱属二年或多年生草本植物。鳞茎颜色是洋葱感官品质的重要组成部分,花青苷的合成和积累会影响洋葱鳞茎颜色的形成。红皮洋葱鳞茎中的主要色素成分是花青苷,其合成受外界环境和自身遗传调控。花青苷作为植物四大天然色素之一,在花粉传播、植物抗逆、抗氧化等方面发挥重要作用。AcMYB1已被证明与洋葱花青苷的合成相关,是洋葱产生花青苷的关键正向调节因子,是其鳞茎产生红色表型的关键。但是关于AcMYB1的下游作用基因以及它的互作基因还不清楚。通过对红皮、白皮洋葱转录组测序结果的数据分析,发现AcbHLH1可能是一个参与调控洋葱花青苷生物合成的bHLH转录因子。此外,先前还在洋葱中发现了 16个涉及花青苷合成结构酶的差异表达基因。其中,AcF3H1和AcANS基因在红皮、白皮洋葱中的表达量差异较大。但通过设计特异性引物对两个基因进行PCR扩增和DNA测序,发现虽然红皮、白皮洋葱中这两个基因存在几个SNP的差异,但这几个SNP的差异并没有引起氨基酸的改变。所以推测引起洋葱红皮、白皮颜色差异的原因可能与AcF3H1和AcANS基因的启动子有关。本研究主要以红皮洋葱‘绣球’、白皮洋葱‘Ringmaster’为材料,进行了 AcMYB1及其互作蛋白的鉴定,以及它们对AcF3H1、AcANS基因是否具有调控作用的研究,主要结果如下:1.获得洋葱AcMYB1、AcbHLH1的cDNA片段,以洋葱鳞茎为材料提取RNA,进行反转录,根据序列设计引物,通过PCR扩增获得长度分别为789bp.1848bp的片段。成功构建了 AcMYB1、AcbHLH1含有GFP荧光蛋白的重组表达载体,瞬时转化烟草结果显示,AcMYB1定位于细胞核,AcbHLH1定位于细胞核和细胞质。2.获得洋葱AcF3H1基因启动子片段,以红皮、白皮洋葱为材料提取DNA,根据序列设计引物,利用染色体步移（Genome walking）技术,通过分级反应扩增特异产物,从而获得红皮、白皮洋葱AcF3H1基因启动子序列。获得洋葱AcANS基因启动子片段,以红皮、白皮洋葱为材料提取DNA,根据序列设计引物,通过PCR扩增获得红皮、白皮洋葱AcANS基因启动子序列。3.成功构建了 AcMYB1、AcbHLH1的PGADT7、PGBKT7重组表达载体,转化酵母感受态,酵母双杂交结果显示只有实验组的酵母菌落AcMYB1与AcbHLH1互作;成功构建植物表达载体,荧火素酶互补实验也验证了 AcMYB1与AcbHLH1互作。4.成功构建了 AcMYB1、AcbHLH1的pB42AD重组表达载体和AcF3H1、AcANS的pLacZi重组表达载体,转化酵母感受态,酵母单杂交结果显示AcMYB1能够与AcANS以及红皮洋葱AcF3H1启动子序列结合,激活这两个基因的表达;而AcbHLH1并不能激活任何一个基因的表达。综上所述,本研究鉴别得到了一个与AcMYB1互作的bHLH转录因子,即AcbHLH1;鉴别获得了AcMYB1的下游靶基因AcF3H1和AcANS。