基于目标循环放大技术的双信号电化学生物传感器的构建及应用

作     者：刘雅兰 

作者单位：湖北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何汉平

授予年度：2019年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 07[理学] 08[工学] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：电化学生物传感器 双信号技术 石墨烯 信号放大技术 杂交链式反应 

摘      要：在能做到早期诊断和充分治疗的情况下,30%-50%的癌症目前是可以得到预防的,许多癌症将会有很高的治愈率,然而很多癌症患者往往都是中晚期才被确诊疾病。DNA作为遗传信息载体和蛋白质编码,在生命过程中发挥核心作用,将遗传密码转化为蛋白质进一步调节多种细胞功能。基于快速的核酸检测手段来实现一些疾病的早期诊断是目前分析化学的研究热点之一。然而在患者早期阶段,其待测疾病标志物含量通常只有痕量,这使得早期诊断在复杂的生物环境中更为艰难。因此越来越需要开发高灵敏度的核酸生物传感器,以便使用简单的方案和便携式仪器快速和低成本地检测痕量的目标生物分子。电化学作为一种表面技术的引入,为生物传感器的检测提供了巨大的优势。它不依赖于反应体积,并且可以使用非常小的样品体积进行测量。电化学DNA传感器将高灵敏度的电化学分析方法和高特异性的生物识别技术相结合构建了一种新型的生物传感器检测平台。此类传感器能够通过将核酸层与电化学换能器组合,为诊断患者提供简单,快速和廉价的平台。本文利用双信号技术增强传感器的稳定性和灵敏度对三核苷酸重复序列CAG和慢粒白血病的基因核酸片段进行定量检测。双信号技术提高了对三核苷酸重复序列长度确定的准确性。本论文主要针对这两种疾病标志物进行研究:(1)结合核酸外切酶Ⅲ辅助循环扩增靶标技术和石墨烯对单链DNA的选择性吸附能力,制备了一种新型的双信号电化学DNA传感器,用于三核苷酸重复序列d(CAG)的定量检测和重复次数检测。双信号分别以二茂铁和亚甲基蓝标记的发夹DNA作为探针,探针DNA可以与目标物杂交形成双链结构,在核酸外切酶的作用下释放出二茂铁和亚甲基蓝标记的单链DNA片段和目标物。释放的目标物参与下一次循环以产生更多的标记单链DNA片段。石墨烯修饰电极能够选择性地吸附释放的探针DNA片段以实现双重电化学信号的检测。在没有目标物存在时,无法与探针DNA形成双链结构,即触发不了核酸外切酶的切割作用,也就无标记单链DNA片段释放。两种信号都与目标物的浓度呈现很好的线性,都可用于测试重复浓度,检测限为0.22 pM。同时通过二茂铁和亚甲基蓝的信号比(F/M)用于确定精确计算目标序列的重复长度。在F/M和重复数n之间发现线性关系,F/M=0.061n+1.97,相关系数为0.992。进一步,也可用于人血清基质的样品的浓度和重复长度的检测,相对标准偏差在2.2%-3.2%之间。这种新型双信号电化学传感器为d(CAG)三核苷酸重复分析提供了一种可靠而有效的方法,并为神经退行性疾病提供了一种潜在的简便的即时检测临床工具。(2)构建了多重信号放大的双信号比率型电化学DNA传感器用于检测慢粒白血病的核酸片段。信号之一就是玻碳电极表面电沉积的普鲁士蓝薄膜,它不仅能增强电极的导电性还能作为该传感器的一个电化学信号。在核酸外切酶循环放大体系中,释放出的目标DNA可以循环作用,而释放出的发夹部分单链DNA可以被捕获到电极上。进一步通过杂交链式反应增长电极表面的核酸,这样通过硫堇吸附到DNA表面再一次信号扩增。期间,由于核酸本身的电子传递能力较弱,阻抗较大,随着电极表面的层层修饰,导致普鲁士蓝的电化学信号下降。利用方波伏安法同时测量普鲁士蓝和硫堇的电化学信号变化情况。在1 pM至100 n M范围内,电化学信号与BCR/ABL融合基因浓度之间观察到良好的线性关系,检测限低至0.19 p M。重要的是,信号比T/P用作确定其浓度具有更高的灵敏度,更为稳定准确,其线性方程lg I=1.094 lg C+0.1557,相关系数为0.997。在人血清基质中的样品检测也具有较高的灵敏度和准确性。这些结果显示所提出的这种新型比率电化学传感具有良好的选择性和灵敏度,而且操作简单,成本低廉。这些说明了该传感在BCR/ABL融合基因诊断上展现了优异的性能,为慢粒白血病的的早期诊断提供了一种简单可行的策略。本工作主要研究了电化学分析方法对三核苷酸重复序列CAG和BCR/ABL融合基因的定量检测。利用核酸外切酶辅助目标循环和杂交链式反应等放大技术构建了简单便捷的双信号电化学DNA传感体系。实验结果均表明都具有良好的线性范围,较低的检测限和优秀的特异性。