土生隐球酵母转录因子Crz1在非生物胁迫中的作用及其与钙调磷酸酶催化亚基CNA的互作研究

作     者：文增叶 

作者单位：昆明理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：年洪娟

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：土生隐球酵母 钙调磷酸酶 Crz1转录因子 胁迫 互作 

摘      要：钙离子是一种重要的细胞内信号,在一些细胞过程及其稳态调节中起着至关重要的作用。当细胞内钙离子增加时,会激活下游包括钙/钙调磷酸酶在内的信号途径相关蛋白,这一信号通路广泛存在于真菌、哺乳动物、寄生性原生生物中。钙(Ca)-钙调磷酸酶级联信号已在真核系统中进行了广泛研究,研究表明,钙/钙调磷酸酶信号途径参与包括氧化胁迫、渗透胁迫、酸碱胁迫、冷和热刺激(温度胁迫)在内的非生物胁迫。CH型转录因子Crz1是钙/钙调磷酸酶信号通路的下游作用底物,钙调磷酸酶通过去磷酸化Crz1,使Crz1核易位和靶基因转录成为可能。Crz1参与调节细胞壁完整性、膜转运、氧化还原过程、碳水化合物代谢、蛋白激酶、编码囊泡介导的转运以及其他代谢和生物过程。CH型锌指转录因子Crz1也存在于土生隐球酵母中,为了验证钙调磷酸酶及转录因子Crz1在酵母抗胁迫中的作用及功能,本研究利用土生隐球酵母为材料进行实验并得到如下结果:用土生隐球酵母在不同钙和镉浓度胁迫条件下进行平板实验,结果显示土生隐球酵母具有较高的耐胁迫能力。为了分析钙调磷酸酶及其下游作用底物Crz1在土生隐球酵母生长和胁迫中发挥的作用,在含50mM钙离子和300μM镉离子浓度下培养不同时间,对土生隐球酵母钙调磷酸酶调节亚基CNB和转录因子Crz1进行荧光定量PCR,在分子水平上分析钙和镉胁迫下基因的表达情况,结果显示,钙和镉胁迫都促进了Crz1和CNB的表达。利用酵母双杂交技术验证了钙调磷酸酶催化亚基CNA和Crz1之间的相互作用。将CNA目的片段构建到pGBKT7诱饵表达载体,将Crz1目的片段构建到pGBKT7猎物表达载体,分别转化Y2HGold和Y187酵母感受态细胞,进行双杂交验证,结果表明CNA和Crz1存在相互作用。利用转基因酿酒酵母INVSc1-pYES3-Crz1检测Crz1基因在耐胁迫包括过氧化氢、钙、镉、铝中的作用。平板检测的结果表明随着胁迫浓度的增加,pYES3/CT-Crz1的转基因酿酒酵母的生长情况都明显高于含有空载体pYES3/CT的对照酵母。过氧化氢在一定浓度范围内能促进酵母生长,超过600μM时,生长受到抑制。钙、镉、铝胁迫的平板实验显示,在胁迫下Crz1能促进菌株生长。测定不同浓度过氧化氢、钙、镉、铝胁迫下转基因菌株的生长曲线,在过氧化氢、铝胁迫下出现延长的延滞期,而钙胁迫、镉胁迫下转基因菌株与无胁迫条件下延滞期无明显差别,其余结果均与平板实验相符,在同样的生长条件下,转基因酵母生长好于转空载酵母。