酪蛋白激酶1ε/δ活性对生物钟节律影响的研究

作     者：郭改丽 

作者单位：安徽大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦曦明

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071008[理学-发育生物学] 

主      题：生物钟 CK1ε 激酶活性 磷酸化 自磷酸化 基因编辑 UPLC 

摘      要：哺乳动物生物钟包括核心生物钟（SCN）和外周生物钟（肝脏、脾和肾脏等）共同维持机体的运行。哺乳动物细胞中的CK1ε和CK1δ蛋白属于酪蛋白激酶家族。CK1ε/CK1δ将ATP上的γ磷酸基团转移到底物蛋白上的丝氨酸、苏氨酸残基上,生成磷酸化的底物蛋白和ADP。CK1ε/CK1δ在生物钟的转录-翻译反馈环路中起着重要作用,机理是磷酸化参与生物钟的蛋白如PER、CRY、BMAL1,调节蛋白活性和核定位等,进而调节生物钟通路。生物钟蛋白的突变会引起生物钟相关疾病,如PER蛋白的S662G突变引起哺乳动物早睡早起,CK1e-R178C和CK1δ-T44A突变会引起睡眠相位提前。但是CK1ε蛋白突变后酶活性的变大或变小存在争议。为进一步研究CK1e蛋白R178C突变对酶活性的影响和CK1ε/CK1δ在细胞中的作用,我们纯化CK1εTAU催化域蛋白（CK1ε-AC-TAU）并对结晶条件做筛选,准备在分子三维水平上解析CK1ε蛋白R178C突变后对酶结构的影响,但遗憾的是没有得到蛋白晶体。纯化CK1e/CK1δ/CK1εTAU N端催化域蛋白和GST-hP53蛋白,探究CK1ε/CK1δ/CK1εTAUN端催化域蛋白对GST-hP53蛋白的活性大小,对结果分析发现催化域蛋白活性由高到低依次是CK1ε-AC-WT、CK1δ-AC-WT、CK1ε-AC-TAU。在 UPLC 实验中通过用 ATP/ADP浓度与峰面积的标准曲线计算一定峰面积下ATP/ADP的浓度,检测在一定时间内 ATP 浓度的减少量,比较 CK1ε-AC-WT/CK1δ-AC-WT/CK1ε-AC-TAU 对底物的酶活性,三种蛋白酶活结果与磷酸化结果一致。用纯化的CK1ε/CK1δ/CK1εTAU全长蛋白做自磷酸化发现CK1ε蛋白自磷酸化活性最高,CK1 εTAU蛋白最低,与催化域蛋白激酶实验中的结果吻合。进一步证实CK1ε突变为CK1εTAU后催化域的活性降低。在细胞中将编码CK1ε/CK1δ蛋白的基因（csnkle/d）敲除后细胞生物钟周期分别延长0.5h和2h,说明CK1ε/CK1δ调节细胞周期,细胞中CK1ε/CK1δ基因敲除后生物钟变长,这也证实了 CK1εTAU全长蛋白酶活性高于CK1ε蛋白。本文从分子水平上揭示了 CK1ε蛋白R178C突变后催化域蛋白活性降低,自磷酸化降低,将细胞中此基因敲除后生物钟周期变长。这让我们对睡眠相位提前和生物钟调控机制有了更深入的了解。