表达猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠体内诱导免疫应答分析

作     者：王书博 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐丽杰

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪圆环病毒2b亚型 Cap蛋白 重组罗伊氏乳酸杆菌 免疫应答 

摘      要：猪圆环病毒病(Porcine Circovirus-Associated Disease,PCVAD)是危害养猪生产的重要免疫抑制性疾病。PCVAD会造成许多综合征,如猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC)、先天性震颤(Congenital Tremors,CT)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)、皮炎与肾病综合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,PDNS)等,另外,由于该病毒引起的宿主免疫抑制,使患畜对其他细菌和病毒的抵抗力降低,从而更容易引发继发感染和混合感染,对养猪业造成了严重的经济损失。虽然现在已有很多商品化疫苗来防控猪圆环病毒2型病毒(Porcine Circovirus2,PCV2),但因为病毒容易变异,致病机理尚不完全明确,生产实践中还不能完全有效控制该病毒的感染。同时由于不同地区分离的PCV2毒株存在遗传变异使其出现多种基因型,其中PCV2b亚型已成为近年来国内流行毒株的优势基因型之一,因此针对流行毒株研制能够有效预防PCV2b感染的新型疫苗对防控PCV2感染具有重要意义。已有研究表明,在感染动物的鼻腔和粪便中可以检测到大量的PCV2病毒,感染PCV2最可能的方式是经由粪口途径,从而进入机体引发感染。作为机体免疫的第一道屏障,黏膜在预防病毒经由粪口途径感染的过程中发挥重要作用,因此采用黏膜疫苗接种对于预防PCV2感染可能是一种有效的保护策略。此外,黏膜免疫具有操作简单,风险性低,可同时诱导局部黏膜免疫和全身免疫,作用效应快且直接的优势。因此,本实验拟从黏膜免疫策略的角度出发,探索开发一种安全有效的新型黏膜口服疫苗来预防和控制PCV2的感染。本实验首先构建了表达猪圆环病毒2b亚型(PCV2b)Cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri)。提取PCV2b基因组DNA,以其为模板应用PCR扩增Cap基因,构建重组质粒pMD-19T-Cap;利用SacⅠ和ApaⅠ限制性核酸内切酶酶切Cap蛋白基因并连接入组成型乳酸菌表达载体pPG-T7g10-PPT质粒中,构建重组表达载体质粒pPG-T7g10-PPT-Cap,经电转化L.reuteriJ31菌株,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-Cap/L.reuteri;经Western blot鉴定目的蛋白可与Cap蛋白单抗发生特异性反应。其次建立了 BALB/c小鼠口服感染PCV2模型。选择BALB/c鼠每只口服PCV2细胞培养毒作为实验组,对照组口服同等剂量的细胞培养液。每天固定时间测量小鼠体温;应用实时荧光定量PCR方法检测小鼠各组织器官病毒载量。结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠在攻毒后体温出现短暂的下降,然后逐渐升高,最终恢复至正常水平;攻毒后5d、10d、15 d,采集小鼠小肠、肺、肝、脾、心,进行病毒载量检测,结果显示,在每个组织中均检测出PCV2的存在,且组织中病毒载量逐渐升高,至攻毒第10 d后水平趋于稳定。第三,系统地进行了表达PCV2b亚型Cap蛋白重组罗伊氏乳酸杆菌口服免疫小鼠的效果分析。选取90只BALB/c鼠随机分为五组:实验组Ⅰ每只小鼠皮下注射300μL猪圆环病毒灭活疫苗(WH株);实验组Ⅱ每只小鼠皮下注射300 μL猪圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗;实验组Ⅲ每只小鼠口服300μL菌体浓度为1×1010 CFU/mL的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-Cap/L.reuteri;实验组 Ⅳ 口服同等剂量的 pPG-T7g1 0-PPT/L.reuteri;实验组V 口服同等剂量的无菌PBS作为对照。免疫程序:Ⅰ组和Ⅱ组小鼠每隔2周免疫一次,共免疫3次。Ⅲ～Ⅴ组小鼠每隔2周免疫一次,每次连续免疫3天,每天1次。分别于免疫前和免疫后不同时间点,间接ELISA方法检测每组免疫小鼠的血清样品IgG抗体水平,结果显示疫苗组和口服重组乳酸杆菌组中的小鼠在初次接种疫苗后第14 d诱导了显著水平的IgG抗体;间接ELISA方法检测不同时间点各组小鼠新鲜粪便、阴道洗液、鼻腔洗液和肠黏液样品sIgA抗体水平,结果显示口服重组乳酸杆菌组小鼠在初次接种疫苗后第21 d开始诱导了显著水平的sIgA抗体,而对照组和疫苗组的sIgA抗体水平免疫前后无明显差异。表明构建的重组罗伊氏乳酸杆菌能够有效诱导机体产生基于PCV2b亚型Cap蛋白的特异性体液免疫应答和黏膜免疫应答。在小鼠脾淋巴细胞增殖实验中,体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞,结果表明重组罗伊氏乳酸杆菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组;流式细胞技术显示口服免疫重组乳酸杆菌的小鼠脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞含量高于对照组;这两个实验结果表明构建的重组罗伊氏乳酸杆菌可以诱导细胞免疫应答。小鼠细胞因子水平检测结果显示与对照组相比,口服重组菌组小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化。结果表明重组罗伊氏乳酸杆菌能够刺激机体产生Th1和Th2型细胞免疫。第四,分析了构建的重组罗伊氏乳酸杆菌口服免疫后对小鼠的保护效果。在初次免疫后的第35 d,分别从五组小鼠中各随机选取12只小鼠,每只口服PCV2细胞培养毒,攻毒后第0 d～15 d,每天固定时间测量小鼠体温变化;在攻毒后第5d、10d和15 d采集各组小鼠的血液、肺、脾、肝和小肠样品,通过实时荧光定量PCR方法检测免疫小鼠各组织中的病毒载量。结果显示,与正常小鼠体温相比,各组小鼠在攻毒后体温均先出现下降趋势,再恢复到正常水平,期间未出现体温高于正常体温的症状;在攻毒后,未经免疫的小鼠各组织中的病毒载量会先持续上升然后维持在稳定水平,疫苗组和口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-Cap/L.reuteri组小鼠在血液、肝、脾、肺和小肠组织中的病毒载量呈现逐步下降趋势,其中口服免疫重组罗伊氏乳酸杆菌组小鼠的小肠内病毒载量下降最为显著,在攻毒15 d后小肠内已检测不出PCV2的存在。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2b Cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-Cap/L.reuteri,经口服途径免疫,重组罗伊氏乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫应答;并且具有一定的免疫保护效果,为防控PCV2提供新的探索思路。