副干酪乳杆菌抗生素耐药性分析及蛋白酶活性评价

作     者：张一爽 

作者单位：哈尔滨工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：崔艳华

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：副干酪乳杆菌 菌株安全性 抗生素耐药性 抗性基因 毒力因子 蛋白水解力 

摘      要：副干酪乳杆菌是重要的益生菌,被人体摄食后可以在人体胃肠道内定殖发挥其益生作用。由于其显著的益生作用,副干酪乳杆菌可应用于发酵乳中促进人体健康。因此研究安全的、具有良好发酵特性的副干酪乳杆菌可以为食品发酵工业优良菌株的选育提供重要的理论基础。菌株在应用食品发酵工业使用前,其安全性评价非常必要。具有抗药性的菌株,有可能将抗药基因转移到人体胃肠道内病原菌中,从而威胁人体健康。表现为溶血性的菌株被人体摄入后可能会引起败血症。因此抗生素耐药性评价及溶血性评价是评价菌株安全性的重要指标。本课题研究实验室前期分离的36株副干酪乳杆菌菌株对十八种抗生素的耐药性评价,以测定副干酪乳杆菌对各种抗生素的敏感程度。同时,也对受试乳杆菌进行溶血性评价。结果发现实验36株副干酪乳杆菌整体安全性较好。31株菌株对11种以上抗生素敏感。只有五株菌株C11、E15、B7、C10、B3对7种以上抗生素具有多重抗性。其中,Y3-1、C3、C2、K5、C7、1482、C6、E14、E17的安全性尤其良好,对14种以上的抗生素都敏感,不易使宿主获得相应的抗生素耐药性。溶血实验中,E15、B6为β溶血,B5、B7、C10为α溶血,其他菌株不产生溶血现象。耐药性基因有可能传递到人体胃肠道的病原菌使其具有抗药性,进而威胁人体健康。此外,细菌中的毒力因子被摄入人体后也可能会对人体健康造成威胁。本研究对抗生素实验和溶血性评价里表现均不佳的C10菌株进行抗生素基因和毒力因子的生物信息学分析,旨在进一步探索C10菌株基因组序列中的抗生素基因及潜在的毒力因子。预测C10基因组含有对rpo B突变体,抗性基因gyr A、gyr B,抗性基因efm A,抗性基因arl R,抗性基因Imr D,抗性基因pat A,抗性基因Isa A,抗性基因vat F。以上基因分别对利福平（rpo B）、氟喹诺酮类抗生素（gyr A、gyr B、emf A、arl R）、大环内酯类抗生素（emf A、Isa A）、林可酰胺类抗生素（Imr D、pat A、Isa A）、链霉素（vat F、Isa A）具有抗性。在对C10的毒力因子分析研究中,预测的毒力因子与多种致病菌同源,如单细胞增生李斯特菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、苏云金芽孢杆菌、血链球菌等,其中,所预测的毒力因子与单细胞增生李斯特菌同源的高达5个。C10基因组中真正毒力因子为cyl R2,hyl A和sag A。cyl R2,hyl A和sag A均与溶血素产生相关,与之前表型实验溶血性评价的结果相吻合。蛋白水解系统在乳酸菌发酵过程中起到重要的作用,且能进行甲硫氨酸半胱氨酸转化能力的菌株可以为副干酪乳杆菌的生长提供重要优势。本研究测定了36株副干酪乳杆菌的蛋白水解力,筛选了含甲硫氨酸半胱氨酸转化关键酶基因簇cys K-ctl-cys E的副干酪乳杆菌,为工业用副干酪乳杆菌菌株的筛选提供一定理论基础。在蛋白水解力测定的实验中,P4、C3、B5、B6、B7、C2、C8、C7等八株菌表现出较弱的蛋白水解力,在发酵过程中体系游离氨基酸的含量低于250μg/m L。而菌株K1、Y3-1、P4-2、C4、C8、C10、B1、B4、E2、E12、E14的蛋白水解力较强,在发酵过程中游离氨基酸的含量高达450μg/m L以上,其中C4和B4蛋白水解力尤佳,发酵时期游离氨基酸产量可高达500μg/m L以上。在蛋白水解力较高的菌株中,C4、C8、B1、E2、E12、及E14凝乳较快。在筛选甲硫氨酸半胱氨酸转化关键酶基因簇实验中,得出含有cys K-ctl-cys E基因簇的有E2、C3,C4,C7,B8,E2,E3,E7,E12,E13,E17,P1,P4,Y3-1。本研究对实验室前期分离的副干酪乳杆菌菌株的抗生素耐药性及溶血性进行分析,同时评价其蛋白水解力,为食品发酵工业优良副干酪乳杆菌的选育提供了一定的理论基础。