鸡源天然免疫DNA感受器cGAS-STING信号轴功能及其抗病毒作用研究

作     者：杨洁 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱建中

授予年度：2020年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：天然免疫 鸡 DNA感受器 cGAS-STING 信号功能 抗病毒免疫 

摘      要：天然免疫通过模式识别受体(PRRs)识别侵入宿主机体的病原相关分子模式(PAMPs)。DNA受体主要识别病原DNA,并通过接头蛋白MyD88或STING诱导产生Ⅰ型干扰素、炎性因子和其它基因表达产物抵御病原入侵。cGAS是2013年发现的新型胞浆DNA受体,它可被病原双链DNA激活,通过合成第二信使2’-3’cGAMP将信号传递给下游接头蛋白STING,诱导Ⅰ型干扰素和相关基因的表达。cGAS-STING通路不仅在抗DNA病毒感染免疫中发挥作用,它还与肿瘤、自身免疫系统疾病密切相关。本研究调查鸡源cGAS(chcGAS)和STING(chSTING)信号功能、相互关系及抗病毒作用。1、鸡源cGAS、STING的克隆、信号功能鉴定和组织分布根据NCBI公布的chcGAS、chSTING序列,设计相应PCR扩增引物,从鸡HD11细胞中RT-PCR扩增出chcGAS、chSTING基因。将基因片段连接至pENTER4-MCS-3FLAG中间载体,再通过LR位点特异性重组,分别构建出chcGAS和 chSTING 的 pcDNA 真核表达质粒。经 Western-Blotting 验证,chcGAS 和 chSTING表达蛋白大小分别为60 kDa和45 kDa。chcGAS和chSTING共转染293T细胞,不能激活ISRE启动子,但能显著激活NF-κB启动子和下游hIL-1β、hIL-8的活性。与此相对照,猪源cGAS和STING共转染293T细胞能激活ISRE启动子;另外chcGAS和猪STING共转染也能激活ISRE启动子。说明cGAS-STING在哺乳动物和禽类中存在种属特异性,STING在种属特异性中发挥关键作用。chcGAS和chSTING单独转染HD11细胞均能激活chIFN-β启动子和下游chIFN-β、chIL-1β、chIL-8的活性,且二者共转染活性显著升高。上述实验证明:chcGAS、chSTING均具有信号活性,通过cGAS-STING信号轴发挥作用。采集三周龄SPF鸡组织,分别检测chcGAS和chSTING转录产物在各组织中的分布。结果表明chcGAS在胰腺中的含量最高,而chSTING在脾脏中含量最高,二者在肠道中的含量均普遍较高。2、chcGAS和chSTING的相互作用及chcGAS信号活性位点研究免疫共沉淀实验结果表明,chcGAS和chSTING能以免疫复合物形式共沉淀,说明chcGAS和chSTING蛋白间具有相互作用关系。分别对chcGAS潜在的镁、锌离子和 ATP、GTP 结合位点 S129、E141、D143、D239、E303、N309、H310、C317、C324、K334、S353-K357位点进行点突变和缺失突变,探究这些位点对chcGAS信号活性的影响。HD11细胞转染结果表明,所有chcGAS突变体均不能激活chIFN-β启动子和下游Ⅰ型IFN表达;而S129A、D239A、H310A突变体chcGAS仍然能诱导下游chIL-1β和chIL-8表达,其余突变体均不能激发下游chIL-1β、chIL-8。293T细胞转染结果表明,E141、N309位点突变具有正常的NF-κB启动子活性和下游hIL-1β、hIL-8转录水平,而其余突变体的NF-κB启动子活性和下游的hIL-1β、hIL-8转录活性均消失。HD11和293T细胞实验结果的差异再一次显示了哺乳动物和禽类的种属特异性。3、chcGAS和chSTING的抗病毒功能研究本研究通过慢病毒感染HD11分别表达chcGAS和chSTING,抗生素嘌呤霉素筛选后获得稳定表达HD11细胞系。同时通过慢病毒感染HD11分别表达特异靶向chcGAS和chSTING的CRISPR gRNAs,抗生素嘌呤霉素筛选后获得chcGAS和chSTING 基因敲除(KO)稳定 HD11 细胞系。通过 45bp-dsDNA、pcDNA3.1、HSV-1刺激稳定表达细胞系检验细胞系的功能。与对照细胞相比,chcGAS和chSTING过表达细胞系对刺激应答能力升高,下游chIFN-β、chOASL、chIL-1β、chIL-8水平升高。与CRISPR对照细胞相比,chcGAS和chSTING KO细胞系对刺激应答减弱,下游基因转录水平降低。在此基础上利用过表达和KO稳定HD11细胞系正反向验证chcGAS和chSTING在抗病毒感染免疫中的作用。痘苗病毒VACV株、水泡型口炎病毒(VSV)、仙台病毒(SeV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、禽白血病病毒(ALV)均能激活下游IFN和NF-κB信号通路;而痘苗病毒SMV株、新城疫病毒(NDV)主要激活下游NF-κB通路。chcGAS 和 chSTING 过表达 HD 细胞中,VACV、SMV、VSV、SeV