芩蓝提取液抗鸡毒支原体感染引起的肺组织细胞凋亡作用研究

作     者：刘玉昊 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李继昌

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸡毒支原体 芩蓝提取液 中药筛选 凋亡因子 氧化应激 

摘      要：鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是在世界范围内广泛存在的能够引起禽类慢性呼吸道病的病原微生物。家禽感染MG后,通常会降低饲料利用率,使肉鸡体重下降,雏鸡的淘汰率上升,成年母鸡产蛋率下降等,给各国养禽业带来巨大的经济损失。因为支原体结构中没有细胞壁,作用于细菌细胞壁的抗生素对于MG感染治疗无效,使可用的抗生素范围缩小,加上抗生素类药物的滥用等问题,所以研发治疗该病安全有效的药物尤为重要。从MG的主要发病机理出发,以扶正祛邪为本,力求标本兼治的中药组方是目前MG防治药物研发的热点方向。本文选取已经被现代医学研究证明,对感染性疾病有明显治疗效果的中药进行组合,首先将以黄芩、板蓝根、紫菀、百部、甘草等为主的11味中药采用二倍稀释法进行逐步抑菌浓度筛选,最终确定抗MG感染的中药组方为黄芩35 g,板蓝根35 g、紫菀20 g、百部20 g、甘草20 g,将其制备成提取液,并以两味主药命名为“芩蓝提取液,以备后续研究应用。采用前期构建MG感染模型的方法进行对雏鸡进行感染,根据其病程发展特点,于MG感染3 d后,开始将芩蓝提取液混水饲喂治疗,试验分为高、中、低剂量组(浓度分别为3.0、1.5、0.5 g/m L),剂量分别为3.0、1.5、0.75g/只·d,连续给药7 d。以泰乐菌素作为阳性药对照组,同时设立空白对照组和模型组。记录体重及用料,计算饲养及治疗期间各组鸡的平均增重及料肉比。分别于饮水饲喂治疗后1、3、7 d剖检取各组实验鸡气管与肺脏,采用透射扫描电镜、ELISA、Real-Time PCR、TUNEL绿色荧光和Western Blot等方法,探讨芩蓝提取液对MG感染造成的细胞凋亡及相关基因表达的影响。由格罗斯气囊病变评分结果可见,芩蓝提取液混水治疗7 d后可以明显减轻MG感染导致的气囊损伤。模型组扫描电镜观察气管部位可以发现纤毛细胞倒伏坏死,脱落固缩,部分纤毛肿胀,顶端形成伞状水肿泡;透射电镜观察肺部组织中,肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤严重,胞质破碎,细胞出现明显凋亡。芩蓝提取液治疗组中各组织细胞损伤和细胞凋亡等病变呈剂量依赖性减轻。由此可见芩蓝提取液可以有效改善MG感染所引起的鸡肺脏和气管的损伤和凋亡。氧化应激相关因子和凋亡相关蛋白的表达结果显示,与模型组相比,芩蓝提取液治疗第7 d时,肺组织中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、过氧化氢酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)表达量明显增加(p0.05),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)表达量显著降低(p0.05),且呈浓度依赖性;Western Blot检测结果显示,与空白对照组比较,模型组凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Caspase-9和Cytcle-C含量明显提高(p0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白含量显著下降(p0.05);此时Caspase-3、Caspase-9、Bax和Cytcle-C的m RNA的表达量也呈现明显增长(p0.05),Bcl-2的m RNA表达量呈现明显下降(p0.05)趋势。相比较于模型组,芩蓝提取液治疗组在给药第1、3、7 d后,肺组织中凋亡因子Caspase-3、Bax、Caspase-9和Cytcle-C表达量明显降低(p0.05),凋亡因子Bcl-2表达量明显上升(p0.05),呈浓度依赖性,且相应促凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Caspase-9和Cytcle-C的含量也显著低于模型组(p0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2的含量明显高于模型组(p0.05),且呈浓度依赖性。在MG诱导HD11细胞损伤模型试验中,经测定芩蓝提取液作用于细胞的最适浓度范围为15～30 mg/m L,最适作用时间为12 h。MG刺激HD11细胞后,细胞培养物中的促凋亡细胞因子Caspase-3、Bax、Caspase-9的m RNA表达均显著上调(p0.05),抗凋亡细胞因子Bcl-2的m RNA表达水平均显著下调(p0.05),而当芩蓝提取液作用于MG处理的HD11细胞后,以上促凋亡细胞因子的m RNA表达水平较MG组均出现了显著下调,并呈浓度依赖性(p0.05)。抗凋亡细胞因子Bcl-2的m RNA表达均较MG组出现了显著上调并呈浓度依赖性(p0.05)。在酶活性检测中,经MG处理的HD11细胞促凋亡细胞因子Caspase-3、Caspase-9的酶活性显著增加,在芩蓝提取液作用于MG处理的HD11细胞后,凋亡细胞因子Caspase-3、Caspase-9的酶活性显著下调并呈浓度依赖性。通过TUNEL