柞蚕表皮构建相关CP12、CP23及BLOS2基因的表达特征及功能研究

作     者：马月月 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦利;王勇

授予年度：2020年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：柞蚕 表皮蛋白 尿酸 溶酶体相关细胞器合成复合体1亚基2 RNA干扰 

摘      要：昆虫表皮是昆虫体壁皮细胞分泌物形成的一种高度有序的层状结构,主要由表皮蛋白（Cuticular Proteins,CP）和几丁质构成。表皮蛋白基因的种类和数量变化是影响表皮结构及其机械性能的主要因素,其中CP中的一类CPR家族在昆虫中含量最多,具有与几丁质结合能力的R＆R保守序列,分为3个亚族RR-1、RR-2和RR-3,都与昆虫表皮形成有关。另一方面,昆虫表皮的不透明与尿酸盐颗粒在皮细胞中积累有关,能减少光氧化对昆虫的刺激。尿酸盐颗粒转运相关的BLOS2基因在此过程中起着十分重要的作用。研究发现BLOS2突变会使昆虫表皮呈半透明状,而柞蚕中暂未发现半透明突变体。为了探究CP和BLOS2基因的表达模式及其在柞蚕（Antheraea pernyi）表皮构建中的作用,采用分子生物学技术研究了3个基因特征和表达模式,并通过RNAi技术探究基因功能,为解析柞蚕体壁的构建奠定基础,实验结果如下。1.克隆得到了柞蚕RR-1亚族的2种表皮蛋白（cuticular proteins,CPs）基因,分别命名为ApCP12、ApCP23（GenBank登录号:MF318874、MF318875）。生物信息学分析:ApCP12基因长度为690 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）长336 bp,编码111个氨基酸,推测蛋白质分子量为12 kD;ApCP23长度为1 243 bp,ORF长度为594 bp,编码197个氨基酸,相对分子质量为23 kD。2种蛋白都具有RR-1亚族的保守基序,与RR-2亚族表皮蛋白聚类分析位于不同分支。组织特异性表明,ApCP12基因在柞蚕幼虫各组织中的分布比ApCP23更为广泛。柞蚕不同发育时期中,ApCP12在胚胎发育期表达量逐渐升高,幼虫眠起3 d内ApCP12的表达量比眠期增加了约3倍,而ApCP23的表达量增加了13倍;蛹黑化时期,ApCP12的表达量高于ApCP23;羽化前期,基因的表达量无明显变化,直至羽化前1 d,ApCP12、ApCP23的表达量相对于注射蜕皮激素第1天分别增加了3.5倍和3倍。取2龄柞蚕幼虫注射siRNA进行RNAi处理,48 h后在3龄幼虫体内检测到ApCP12的表达量下降了5倍,ApCP23降低了3倍,但并未出现明显的表型变化。结果显示RR-1亚族的这2种柞蚕表皮蛋白参与了柞蚕不同发育阶段幼虫表皮、蛹皮、成虫表皮的构建,与柞蚕生长发育的整个生命周期关系密切。2.克隆得到BLOS2基因,命名为ApBLOS2（GenBank登录号:MT038419）,序列长为4300 bp,包含4个外显子和3个内含子,ORF长438 bp,编码145个氨基酸,蛋白分子质量为16.9 kD。同源序列比对分析显示ApBLOS2与同属大蚕蛾科的蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricini）BLOS2蛋白氨基酸序列一致性为84.03%。qPCR检测发现柞蚕胚胎发育期ApBLOS2基因均有表达,蚁蚕期表达量开始降低。组织表达谱显示,ApBLOS2在表皮、精巢/卵巢、血淋巴中表达量相对较高,3龄眠期到4龄眠起表达量上升了4.13倍。取2龄第3天柞蚕幼虫注射BLOS2基因双链RNA（dsBLOS2）进行干扰,在干扰48 h后相比对照组（注射绿色荧光蛋白基因双链RNA,ds EGFP）,幼虫ApBLOS2基因表达显著降低。对4龄眠期幼虫进行RNAi处理结果显示,ApBLOS2除基因表达水平下降31.77%外,注射dsBLOS2的幼虫个体5龄眠起后血淋巴中的尿酸含量升高了1.51倍,表明ApBLOS2基因在柞蚕尿酸盐颗粒从血淋巴向表皮细胞转运过程中起着关键的作用。