芋螺毒素作用靶位鉴定及抗毒素制备

作     者：唐艺菲 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡小波;戴秋云

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：芋螺毒素 烟碱型乙酰胆碱受体 抗毒素 抗毒活性 

摘      要：目的:本课题组前期从中国南海中获得一系列含新半胱氨酸框架A-超家族及M-超家族芋螺毒素,本论文开展了新芋螺毒素的合成及其对烟碱型乙酰胆碱受体作用活性的测定;此外制备了毒性极强α-芋螺毒素GI的抗毒素并测定其抗毒活性。上述工作为发现新的镇痛分子、特异神经药理学的研究工具及芋螺毒素中毒的治疗等奠定基础。方法:采用Fmoc-固相肽合成法合成芋螺毒素线性肽,裂解后通过空气氧化折叠法获得含二硫键的芋螺毒素,再利用双电极电压钳方法测定各肽是否作用于烟碱型乙酰胆碱受体靶点;将α-芋螺毒素GI与戊二醛反应,然后将其偶联至BSA上,将上述偶联产物免疫小鼠,制备抗血清,并测定抗血清对GI毒素的中和活性。结果:(1)合成了10个含4个单C的A超家族芋螺毒素以及独特的二硫键框架结构的芋螺毒素Mr6和Eb5。(2)着重筛选了5个芋螺毒素对nAChRsα9α10抑制活性,结果表明,Bt22.1可选择性抑制nAChRsα9α10,其IC为124.6 nM,而Bt14.12、Bt14.5、Eb5及Mr6对nAChRsα9α10活性较低(IC10μM);进一步研究表明Bt22.1对α2β4、α3β4、α4β4、α7的抑制活性很低(IC10μM),显示其具有很高的选择性。(3)Eb5则能选择性抑制人肌肉型nAChRs,其IC为142.8nM,而与之相差一个氨基酸的Mr6对肌肉型乙酰胆碱受体在10μM抑制率也可达95%以上。(4)GI-BSA偶联的SDS-PAGE蛋白电泳显示GI与BSA成功偶联。GI-BSA(99μg/只)第四次免疫后第10天抗血清中和滴度效价大于1:64000。混合100μl及200μl小鼠抗血清与1个LD或高于LD剂量GI,腹腔注射,100μl血清可保护1×LD毒素(12.5μg/kg)组小鼠75%存活,200μl血清可保护25.8μg/kg毒素组小鼠75%存活。(5)此外,本论文探索了GI与八分肽偶联及带有保护基团GI与五乙烯六胺反应制备新型抗原试验,结果表明偶合物组分较杂,需进一步改善反应条件。结论:新型芋螺多肽Bt22.1选择性抑制nAChRsα9α10亚型,Eb5、Mr6选择性抑制肌肉型nAChRs,该类芋螺毒素二硫键框架新颖,此类芋螺多肽的作用靶点发现将为其功能研究、进一步改造及应用提供重要的依据。从GI-BSA半抗原免疫的小鼠中提取的抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用。