PK2/PKRs在二甲双胍保护糖尿病睾丸损伤中的作用

作     者：刘宇宁 

作者单位：湖北科技学院 

学位级别：硕士

导师姓名：查文良;孔东波

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：糖尿病 PK2 PKR Akt/GSK-3β 细胞凋亡 

摘      要：目的:研究PK2/PKRs在糖尿病睾丸损伤中的作用,进而研究PK2/PKRs在二甲双胍保护糖尿病睾丸损伤的作用机制。方法:第一部分,160只18-22 g SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组(control组,n=60)、糖尿病模型组(DM组,n=100)。适应性喂养一周后,小鼠禁食不禁水12 h,DM组小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50mg·kg·d,临用前用0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH4.4配成10 mg/mL浓度使用),control组小鼠同时段连续5天腹腔注射等容量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。STZ注射7天内监测小鼠随机血糖,随机血糖均≧16.7 mmol/L的小鼠被诊断为糖尿病小鼠,随后每周监测一次随机血糖。在诊断糖尿病后2个月(2M)、3个月(3M)、4个月(4M)、5个月(5M)的时间点麻醉小鼠并进行安乐死,迅速取出睾丸组织并保存,摘取小鼠附睾尾部进行精子活力及精子浓度计数,光学显微镜下观察小鼠睾丸组织结构,Western blot检测小鼠睾丸组织中PK2、PKR1、PKR2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达变化。第二部分,70只18-22 g SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组(control组,n=20)、糖尿病模型组(DM组,n=25),二甲双胍治疗组(DM+Met组,n=25),糖尿病模型构建及诊断同第一部分。DM+Met组小鼠诊断为糖尿病后予以250 mg·kg·d的盐酸二甲双胍溶液饮水,持续4个月,其余各组给予凉开水。Met治疗4个月后麻醉小鼠并进行安乐死,迅速取出睾丸组织并保存,摘取小鼠附睾尾部进行精子活力及精子浓度计数,光学显微镜下观察小鼠睾丸组织结构,荧光显微镜下观察睾丸组织血睾屏障完整性,透射电镜观察睾丸细胞超微结构变化。末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)染色法观察睾丸组织的凋亡情况,免疫组化法及RT-qPCR观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、PCNA和PK2、PKR1、PKR2的表达情况;Western blot检测小鼠睾丸组织PK2、PKR1、PKR2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β、Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白P62、LC3B、Beclin-1蛋白表达变化。结果:与control组相比,DM组小鼠毛发稀疏无光泽,随机血糖持续升高(P0.05),伴随糖尿病造模时间的延长,小鼠体重和睾丸重量逐渐下降(P0.05),精子活力和精子浓度明显减少(P0.05),睾丸生精小管失去典型结构,并且糖尿病小鼠在不同时间点PK2、PKR2、p-Akt和p-GSK3β水平均显著降低(P0.05),而PKR1水平显著升高(P0.05),这些变化通过Met治疗后得到了恢复。此外,Met还可以修复睾丸组织血睾屏障的完整性,减弱睾丸组织凋亡相关蛋白表达(P0.05)并诱导自噬相关蛋白表达(P0.05)。结论:通过多次小剂量注射STZ(50 mg·kg·d)的方法成功造模糖尿病小鼠模型,并随着病程的延长小鼠睾丸组织损伤逐渐加重,PK2/PKRs在小鼠糖尿病睾丸损伤中发挥不可替代的作用。Met可通过抑制细胞凋亡和诱导自噬来挽救糖尿病所致的睾丸损伤,其机制可能是通过PK2/PKR/Akt/GSK3β信号通路。