果胶甲酯酶基因PME21调节拟南芥花粉发育及花粉管生长的研究
作者单位：山东农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：高新起;张宪省
授予年度：2020年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种]
摘 要：被子植物通过花粉管的生长将两个精子细胞运送到胚囊中,与卵细胞和中央细胞融合形成受精卵和胚乳,完成双受精过程。因此,花粉管的生长对于植物完成双受精是至关重要的。胞吐和内吞在维持花粉管的生长过程中起到重要作用。果胶甲酯酶(PME)使高甲酯化的果胶质去甲酯化,形成的低甲酯化果胶质与Ca交联,从而维持花粉管硬度,在花粉发育和花粉管生长过程中起到重要的作用。PME能够通过胞吐的方式到达花粉管前端的细胞壁从而发挥功能,而其是否会参与内吞过程却不清楚。拟南芥TML基因编码一个内吞复合体亚基,可以与货物蛋白结合。前期我们通过酵母双杂交筛选得到一个与其互作的蛋白pectin methylesterase 21(PME21)。PME21基因从12时期开始在花粉及花粉管中高量表达,这与TML在花粉/花粉管中的表达模式一致。对PME21的亚细胞定位进行观察发现,PME21分布在花粉的萌发孔以及花粉管的顶端。我们在前期的研究过程中鉴定到一个拟南芥T-DNA插入的突变体pme21-1。与TML突变体一致,pme21-1/+大约有一半的花粉形态异常。进一步观察发现花粉是从12时期开始出现活力异常,且花粉中的胼胝质和果胶质异常积累,与TML的突变体表型相同。同时我们还利用CRISPR/Cas9技术对PME21进行突变,得到一个新的有效突变体pme21-2,测序发现该突变体中在起始密码子ATG后350 bp处插入了一个胸腺嘧啶T导致翻译至120个氨基酸处终止。pme21-2/+突变体中雌雄配子体异常,这与pme21-1/+突变体表型相一致。为了研究PME21在花粉管生长过程中所起到的作用,我们构建了雌激素诱导的pER8::amiRNA-PME21转基因株系。观察转基因花粉的体外萌发发现,下调PME21的表达会使花粉管在生长过程中发生破裂。同时我们还观察到转基因花粉管能在经雌激素诱导的野生型柱头上正常生长,但部分花粉管无法穿过柱头进入引导组织。统计后发现在限量授粉情况下,经雌激素处理的雌蕊中花粉管生长异常所占的比例要比未经处理的雌蕊中花粉管生长异常比例多10%左右。这些结果表明下调PME21的表达,会对花粉管在雌蕊中的生长造成一定的影响。PME21属于Type2 PME,其N端包含一个PRO区域(包括一个信号肽序列和一个PMEI结构域),C端包含一个PME结构域。有研究表明,Type2 PME会在PMEI结构域和PME结构域之间被切开,成为两个被截断的蛋白。为了探究这两个被截断蛋白的定位,我们构建了pPME21::mCherry-PME21-GFP载体转化拟南芥,观察了转基因株系花粉管中红色荧光和绿色荧光的分布。研究发现mCherry-PME21定位于花粉管质膜和细胞壁,而PME21-GFP则定位于顶端质膜和细胞壁。同时也分析了在生长状态下的花粉管中PME21-mCherry和mCherry-PME21-GFP定位的动态过程,发现PME21-GFP可能还与花粉管生长方向有关。我们原先的研究表明,TML和PME21之间存在直接的互作,暗示PME21可能是TML参与内吞的货物蛋白。为此我们观察了PME21-mCherry和TML-YFP的共定位情况,发现TML和PME21在花粉管顶端侧面存在共定位。此外,下调TML表达后PME21在花粉管顶端的定位消失或是向后延伸,由此表明PME21在花粉管顶端的定位可能受TML参与的内吞过程调控。随后我们又利用一种内吞抑制剂TyrA23处理了转基因花粉管,发现PME21中PME结构域的定位受到了影响,进一步证实了PME21会发生内吞。由此我们得出了这一结论:TML可以通过内吞成熟的PME21来调控花粉发育和花粉管生长等过程。
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