泡叶藻岩藻聚糖制备及其在高脂诱导C57BL/6J小鼠中的降脂机制

作     者：杨自勋 

作者单位：哈尔滨商业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭守东

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：泡叶藻 岩藻聚糖 胆固醇外排 胆固醇逆向转运 脂代谢 

摘      要：心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular disease,CVD)是危害人类健康的重大疾病之一。有效的降脂治疗可有效降低其病发率和致死率。目前降脂药物多以合成化合物为主,长期服用会产生严重的不良反应。岩藻聚糖(fucoidan)属于褐藻多糖,是一种高度复杂的硫酸化生物活性多糖,据报道,其在体内外具有多种生物活性。本研究采用水提醇沉法从泡叶藻(Ascophyllum nodosum.A.n)中提取A.n岩藻聚糖粗品,得率为3.8%;利用?KTA-FPLC pure 150蛋白纯化系统结合阴离子交换柱(Q-Sepharose Fast Flow,QFF)及分子筛层析柱(Sephacyl S-200 H.R)对Aw进行分离纯化,最终得到A1、A2和A3三个组分,得率分别为14.1%、32.3%和41.5%;本研究中,由于A2组分的岩藻糖占比(77.6%44.0%)以及硫酸根含量(16.6%12.0%)均高于A3组分。所以,选用A2进行随后的实验。运用凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography,GPC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)及红外光谱法(infrared spectroscopy,IR)等途径研究A.n岩藻聚糖A2结构特征。GPC结果显示,A.n岩藻聚糖A2的重平均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和z均分子量(Mz)分别为207.2kDa、655.1 kDa和555.1 kDa。其糖含量、蛋白含量和硫酸根含量分别为60.4%、0.1%和16.6%。HPLC结果显示,A.n岩藻聚糖A2主要由甘露糖、半乳糖、木糖和岩藻糖构成,摩尔比分别为1.0:1.1:5.4:26.0。本文借助高脂诱导的C57BL/6J小鼠模型探讨其降脂活性及机制,以25只C57BL/6J小鼠(雄性,23±4 g)为实验对象,随机分为5组,即空白对照组(n=5)、模型组(n=5)、非诺贝特组(n=5,50 mg/Kg/d)、低剂量A.n岩藻聚糖组(n=5,50 mg/Kg/d)和高剂量A.n岩藻聚糖组(n=5,200 mg/Kg/d)。空白组小鼠喂食普通饲料,其余各组小鼠喂食高脂饲料(含21%脂肪和0.15%胆固醇)。灌胃给药6周后采集小鼠的血液及各脏器组织样本。采用Western blot分析A.n岩藻聚糖A2对肝脏及小肠样本RCT相关蛋白表达的影响。实验结果显示:A.n岩藻聚糖A2可以显著降低高脂血症小鼠的甘油三酯(triglyceride,TG),总胆固醇(total cholesterol,TC)水平和附睾脂肪指数,同时提升高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholestrol,HDL-C)的水平;在肝脏中,A.n岩藻聚糖能够显著上调B类1型清道夫受体(scavenger receptor class B type 1,SR-B1)、低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)、过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)α和γ、肝脏X受体(liver X receptor,LXR)β、ATP结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter,ABC)A1和G8和胆固醇7-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxy-lase,CYP7A1)蛋白表达水平,下调前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白表达水平;在小肠中,A.n岩藻聚糖A2可以显著上调ABCG8和ABCG5的蛋白表达水平,下调了尼曼-匹克C1样1(niemann-pick C1-like 1,NPC1L1)的蛋白表达水平。综上所述,A.n岩藻聚糖A2对高脂诱导的C57BL/6J小鼠具有良好的降脂作用,其降脂机制是通过多重途径共同完成,机制如下:(1)与非诺贝特相类似,A.n岩藻聚糖A2可激活肝脏中的PPARα和LXRβ/ABC途径;(2)A.n岩藻聚糖A2可通过激活SR-B1和LDLR,同时抑制PCSK9的表达来提高肝脏对血浆中脂质的摄取;(3)A.n岩藻聚糖A2可通过提高CYP7A1的表达,促进胆汁酸合成;(4)A.n岩藻聚糖A2可以通过抑制NPC1L1和激活ABCG5和ABCG8来降低胆固醇的吸收并增加胆固醇的分泌。此外,岩藻聚糖还可以通过下调胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element b