巴西日圆线虫及其来源蛋白干预动脉粥样硬化发生发展的研究

作     者：吴小珉 

作者单位：江苏省血吸虫病防治研究所 

学位级别：硕士

导师姓名：曹俊

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：巴西日圆线虫 钩虫 THP-1 动脉粥样硬化 干预 巨噬细胞 极化 

摘      要：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以脂质代谢异常和炎症细胞浸润为主要特征的慢性炎症性疾病。炎症反应贯穿于其发生、发展的整个过程。抗炎干预成为动脉粥样硬化防治的一个重要方向,控制或阻断炎症反应可有效延缓动脉粥样硬化的发生、斑块破裂和血栓的形成。研究发现,巨噬细胞在动脉粥样硬化发生、发展的炎症反应过程中起着十分重要的作用,其参与了脂质沉积、泡沫细胞形成、动脉粥样硬化斑块的形成与稳定等一系列病理生理过程。通过特异性的抑制M1型诱导因子或增强M2型诱导因子的表达水平,均可有效缓解AS的发生发展。流行病学调查显示,随着蠕虫感染率的下降,人群过敏性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病的发病率呈上升的趋势。蠕虫感染或蠕虫来源的分子对自身免疫性、过敏性及代谢性等炎症相关疾病有明显的干预作用,这为此类疾病的预防和治疗提供了新的思路。既往的研究结果显示,钩虫感染及其来源产物可通过诱导宿主产生特异性的II型免疫应答、M2型巨噬细胞极化有效干预克罗恩病、过敏性哮喘及宿主脂质代谢等。因此,本研究提出通过钩虫感染及其来源蛋白诱导宿主产生II型免疫应答及M2型巨噬细胞极化从而干预动脉粥样硬化发生发展的科研假说。为验证以上假说,本研究通过体外细胞实验,从细胞形态、mRNA、细胞标志物、细胞因子分泌等方面观察巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导巨噬细胞极化情况;进一步应用ApoE小鼠动物模型,在动脉粥样硬化形成过程中和形成后,分别采用巴西日圆线虫感染及其来源蛋白等进行干预,通过动脉、肝脏组织病理切片、血清脂质、细胞因子等水平的检测,综合评估巴西日圆线虫感染及其来源产物干预动脉粥样硬化发生发展的效果。一、巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞极化的研究维持巴西日圆线虫培养的实验室循环,无菌条件下收集L3和L5虫体,分别制备来源蛋白;利用THP-1细胞的体外培养体系,THP-1细胞经佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA,浓度500 ng/mL)刺激培养后转化为贴壁状态的M0细胞,分别采用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)+IFN-γ(浓度分别为500ng/mL和100ng/mL)、IL-4+IL-13(浓度均为100 ng/mL)、L3及L5来源蛋白(浓度均为5?g/mL)进行刺激,通过显微镜镜检、RT-qPCR、流式细胞术及ELISA等方法进行刺激后细胞形态学观察、M1/M2型巨噬细胞特异性基因mRNA表达水平检测、细胞标志物的检测和分泌M1/M2型细胞因子含量的检测,观察巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞的极化方向。结果显示THP-1经PMA刺激培养转化为贴壁的M0细胞后,经LPS+IFN-γ刺激培养后呈现特征性的M1型极化的改变,呈扁平圆形;经IL-4+IL-13刺激培养后呈现特征性的M2型极化的改变,呈修长梭形;经L3和L5蛋白刺激培养后均呈现特征性的M2型极化的改变,呈修长梭形;LPS+IFN-γ刺激组的M1型巨噬细胞数量高于其他4组;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组的M2型巨噬细胞数量高于阴性对照组和LPS+IFN-γ刺激组。RT-qPCR结果显示,LPS+IFN-γ刺激组CCL2、TNF-α、IL-12b等M1型巨噬细胞相关基因mRNA表达水平显著高于其他4组,差异均具有统计学意义(P0.05)。细胞因子检测分析显示,L3蛋白、L5蛋白干预可以下调部分Ⅰ型细胞因子分泌水平,如第20w IL-6分泌水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.05);L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫干预均可以上调部分Ⅱ型细胞因子,如巴西日圆线虫感染组从第16w起IL-10水平显著上调,L3蛋白组、L5蛋白组第20w IL-10分泌水平显著上调,差异均具有统计学意义(P0.05)。研究结果显示,巴西日圆线虫及其来源蛋白在一定程度上缓解动脉粥样硬化的发展,表现为动脉粥样硬化斑块的大小和坏死核心面积的下降,干预后特异性诱导产生的IL-10可能发挥了一定的作用。