鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究

作     者：戴玉 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王方昆

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：柔嫩艾美耳球虫 EtSAG13 亚细胞定位 分泌蛋白 亚单位疫苗 

摘      要：柔嫩艾美耳球虫(***)是分布最广、致病力最强的几种球虫之一,严重危害养禽业,造成重大的经济损失。目前药物防治是控制球虫病的有效手段,但随着抗球虫株的产生及绿色食品概念的形成,抗球虫新型疫苗的研究成为热点。*** SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1细胞感染模型,通过分泌蛋白质组分析筛选到的一种上调表达蛋白。为探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作为候选疫苗抗原蛋白,本研究对EtSAG13基因进行原核表达,以***子孢子cDNA为模板进行扩增,按照GenBank的基因序列合成引物,将合成的EtSAG13基因序列连接到pET28a(+)载体上,构建了pET28a-SAG13重组质粒,并将pET28a-SAG13重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导EtSAG13目的基因的表达;用SDS-PAGE及免疫印迹法对表达蛋白进行分析和鉴定。将EtSAG13表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,进行亚细胞定位,EtSAG13定位在***子孢子的表面,同时部分蛋白可以分泌到裂殖子细胞外,具有分泌特性。本研究将pET28a-EtSAG13亚单位疫苗组作为试验组,通过鸡球虫攻毒试验,对EtSAG13蛋白重组亚单位疫苗免疫效果进行了评价。将90只个体差异不大的雏鸡随机分成1组(EtSAG13免疫感染球虫组)、2组(不免疫不感染球虫组)、3(不免疫感染球虫组),每组30只鸡,以比较pET28a-EtSAG13亚单位疫苗的免疫效果。7日龄时,用完全弗氏佐剂充分乳化后的蛋白对1组进行颈部皮下多点注射,免疫剂量为100μg/只,另外两组注射等量PBS;待14日龄时,用不完全弗氏佐剂等比例乳化EtSAG13蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对1、3组接种2万个新鲜的具有感染活性的***孢子化卵囊。免疫结果表明:pET28a-EtSAG13亚单位疫苗免疫后,鸡体的CD3CD4和CD3CD8比例显著升高,表明该免疫能诱导显著性的细胞免疫反应和体液免疫反应;在盲肠病变计分(LS)方面,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组(1组)的雏鸡盲肠病变计分显著低于不免疫攻虫组(3组)(p0.05);试验组鸡与不免疫攻虫的对照组相比增重明显,且卵囊排出量显著下降,肠道损伤明显减轻;在血清抗体检测中,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组(1组)的雏鸡IgG水平显著高于空白对照组和不免疫攻虫组。试验结果表明,EtSAG13蛋白定位在子孢子表面,并能够分泌到细胞外,具有分泌特性;EtSAG13蛋白亚单位疫苗能够对***感染提供一定的免疫保护力。本研究鉴定了EtSAG13蛋白的分泌特性和免疫原性,为下一步研究EtSAG13蛋白在入侵过程中的具体分子功能和研制新型鸡球虫疫苗提供基础。