小鼠生精细胞AAV特异表达载体的构建及表达验证

作     者：李雅惠 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨涛;宋伟

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：Dazl 特异启动子 基因治疗 精子发生 

摘      要：目的:1.分别构建含有小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2和Prm1的AAV特异表达载体,验证并筛选有效特异启动子。2.构建小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag,并且从体内、外验证其表达特异性。方法:1.筛选小鼠生精细胞特异启动子通过同源重组的方法分别构建含有小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2和Prm1的AAV特异表达载体,分别转染生精细胞GC1细胞,通过比较5种载体在GC1细胞中的表达情况筛选有效的小鼠生精细胞特异启动子。2.构建小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag通过同源重组的方法将小鼠生精细胞特异启动子Dazl片段与酶切后去除CMV启动子的腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag连接,并通过双酶切和基因测序验证小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建。3.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag体外验证将腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag及小鼠生精细胞特异表达载体AAV-DazlRFP-Flag分别转染GC1细胞和293T细胞。收集细胞爬片,通过免疫荧光检测细胞中RFP的表达情况。收集细胞沉淀,通过RT-qPCR和western blot检测细胞中RFP的RNA和蛋白的表达情况。4.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag体内验证将腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag及小鼠生精细胞特异表达载体AAV-DazlRFP-Flag分别进行病毒包装。将包装好的病毒通过显微注射技术注射到3周ICR小鼠睾丸的曲细精管中。1周后取睾丸组织,通过体视显微镜和免疫荧光检测小鼠睾丸中RFP的表达。提取睾丸组织的RNA,通过RT-qPCR检测小鼠睾丸中RFP的RNA表达情况。结果:1.小鼠生精细胞特异启动子Dazl、Stra8、Hspa2、Pgk2均可以在GC1细胞启动目的基因RFP的表达,并且Dazl启动子启动效率较高。2.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag构建成功。3.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag在GC1细胞与293T细胞中均有表达,但在293T细胞中的表达水平低于GC1细胞。4.小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag在小鼠睾丸组织的RNA水平检测到RFP的表达,但未检测到其表型。结论:1.从5个生精细胞特异启动子中筛选出Dazl启动子。2.在生精细胞的RNA水平检测到小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Daz1-RFP-Flag的表达。