短密青霉的筛选鉴定和液体深层发酵技术的研究

作     者：闵聪 

作者单位：大连工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张宗申;崔耀军

授予年度：2018年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：短密青霉 液体深层发酵 霉酚酸 向天果 白桦茸 HPLC 

摘      要：短密青霉(Penicillium brevicompactum)属散囊菌纲,散囊菌亚纲,散囊菌目,是一种丝状真菌。短密青霉液体深层发酵的次级代谢产物具有不同的生物活性,有代表性的如霉酚酸,具有重要的药用价值。本研究从白桦茸子实体中筛选,纯化,鉴定得到短密青霉;对其次级代谢产物霉酚酸进行HPLC分析;单因素试验优化短密青霉液体深层发酵条件;利用正交分析研究短密青霉和向天果提取物的双向发酵条件。研究结果如下:首先,从白桦茸子实体上筛选,纯化得到纯菌株,对其基因组DNA进行提取和PCR扩增,并且对其进行18S rDNA序列分析,构建进化树,根据Blast比对结果结合形态特征鉴定样本中菌种MC-4为短密青霉。对短密青霉液体深层发酵产物(样品)和霉酚酸标准品进行HPLC分析,测得在同等色谱条件下霉酚酸标准品和样品的保留时间均为4.763 min,所测样品中霉酚酸的浓度为65.40%。然后,将筛选鉴定得到的短密青霉在PDB培养基的基础上,单因素试验法确定短密青霉最适的液体深层发酵条件为:薯蓣(多糖)含量100 g、温度24℃、转速130 r/min、初始pH=6。依据优化的短密青霉液体深层发酵条件,研究其生长周期得出:0 d为调整期,2 d为对数增长期,6 d为稳定生长期,82 d为衰亡期,第6 d短密青霉液体深层发酵产物霉酚酸含量最高,达到1.415 g/L。最后,为了降低短密青霉的细胞毒性,双向发酵短密青霉和向天果提取物,使用单因素试验确定向天果超声提取条件为:甲醇浓度80%、提取料液比1:15(m/v)、提取时间30 min和提取温度70℃时,向天果的醇溶性物质的提取量为1.5%,利用正交试验参照短密青霉液体深层发酵条件,优化短密青霉和向天果提取物的双向发酵条件。对筛选鉴定得到的短密青霉进行液体深层发酵,通过HPLC分析得出短密青霉的次级代谢产物为霉酚酸。霉酚酸是抗癌、抗肿瘤的良好药物,双向发酵短密青霉和向天果提取物可以达到提高药效、增加安全性和降低毒副作用等功效,对液体深层发酵条件的优化可以提高短密青霉的次级代谢产物霉酚酸的产量,最大可到1.537 g/L。