B-酯酶检测方法的比较研究

作     者：陈泠伶 

作者单位：西华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈祥贵

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：乙酰胆碱酯酶 丁酰胆碱酯酶 花芸豆酯酶 农药 敏感性 

摘      要：农药是指用来防治危害农业及农副产品的害虫、杂草和调节植物生长的药剂,在农业生产中发挥着重要作用,然而农药使用过量、不当会污染环境和农产品,造成人、畜中毒和死亡。因此,研制出经济、快速、灵敏的农药残留检测技术有利于控制农药残留,减少因农药中毒的事件发生从而保障食品安全。氨基甲酸酯类和有机磷类农药是在农业生产中常用的农药,其残留问题也值得高度重视。本论文分别选择了3种有机磷农药(敌敌畏、敌百虫、久效磷)和2种氨基甲酸酯类农药(灭多威、涕灭威),选取B-酯酶种族中的三种酶电鳗乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,AChE)、马血清丁酰胆碱酯酶(Butyryl cholinesterases,BChE)、花芸豆酯酶作为酶源。胆碱酯酶是能催化水解胆碱酯酶且有不同专业性的水解酶,分为AChE和BChE,它们主要是有机磷和氨基甲酸酯类农药的最适反应底物,其主要来源是动物,成本高,难保存。花芸豆酯酶是一种植物酯酶,植物酯酶酶源丰富且成本低,易于保存,通过实验得出花芸豆纯化后的酶活相对较好。本论文运用两种方法荧光法和比色法,比较该两种方法检测常见5种农药对B-酯酶的灵敏性和检出限,以及两种方法在蔬菜样品中运用并在研究中发现环糊精衍生物对荧光有增敏作用。通过这2种方法比较3种酶对于常用5种农药的敏感性与检出限的不同,运用到蔬菜样品中的研究,可以为快速检测农药提供更好的方法以及在实际样品种运用提供新的思路,为酶抑制法检测酶源提供依据。其主要研究结果如下:1.比色法测定花芸豆酯酶、AChE、BChE酶活的最佳温度为40℃、35℃、35℃,最佳pH为6.5、7.5、8.0,最佳时间均为15min。2.电鳗AChE、马血清BCh E、花芸豆酯酶在荧光法中,反应的最适pH、温度、时间分别为6.5、35℃、15min。3.比色法与荧光分光光度法分别检测农药对花芸豆酯酶、AChE、BChE的IC值时比色法和荧光法检测5种农药对电鳗AChE、花芸豆酯酶、马血清BChE的抑制情况,随着5种农药浓度的负对数值逐渐增大,即农药的终浓度不断减小抑制强度也不断减弱。荧光法检测三种酶对5种农药敏感性比用比色法更灵敏,检出限更低。4.荧光法和比色法测定电鳗AChE、马血清BChE、花芸豆酯酶对5种农药的检出限时,荧光法测定的检出限较比色法更低更灵敏。5.5种蔬菜研磨匀浆经丙酮处理后用酶抑制法检测时对酶影响作用不大,对红油菜的影响效果最大超过30%。酶抑制法能应用于检测蔬菜中有机磷及甲酸酯类农药残留。6.不同浓度蔬菜的反应溶剂,对荧光都有淬灭作用,不同蔬菜样品液稀释浓度不同,对荧光的淬灭效果不同。7.蔬菜液对4-甲基伞形酮和吲哚乙酸酯都有淬灭作用,说明蔬菜液对底物无特异性,对荧光都有淬灭作用。***-β-CD溶液浓度为400mg/mL时荧光增强效果最好,荧光增加5倍。三甲基-Beta-环式糊精浓度为40mg/mL时荧光增强效果最好,荧光增加3.5倍。9.引起荧光淬灭现象的原因有很多,机理也很复杂,如因荧光物质的分子和淬灭剂分子碰撞而损失能量。荧光增强剂能缓解一部分荧光淬灭,但提高荧光持续的能力不强。在实验中还用了增稠剂聚乙烯吡络烷酮、黄原胶,乙二胺四乙酸、十六烷基三甲基溴化铵等来减少蔬菜液对荧光的干扰,虽然对荧光有增强效果但是作用不强,运用在实际样品中时效果不好。