TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）通过NF-κB/PP2Ac/COL6A1途径促进肺癌进展的机制研究

作     者：葛鑫鑫 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：段卫明

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤相关巨噬细胞 肺癌 PP2Ac NF-κB CXCL1 COL6A1 

摘      要：第一部分:TAMs在肺癌进展中的作用目的:探讨TAMs(Tumor Associated Macrophages,肿瘤相关巨噬细胞)浸润是否促进肺癌的进展。方法:免疫组化方法检测339例肺癌患者中CD163、Ki67蛋白水平的表达,并分析CD163与Ki67之间的关系;建立裸鼠慢性肺炎模型及原位肺癌模型,观察TAMs在体内对肺癌生长的影响;MTT实验检测TAMs在体外对肺癌细胞生长的影响;划痕实验检测TAMs在体外对肺癌细胞迁移的影响;免疫荧光检测TAMs在体外对肺癌细胞EMT(Epithelial-mesenchymal transition,上皮间质转化)的影响。结果:肺癌患者标本中CD163与Ki67表达呈正相关;TAMs可促进肺癌生长、迁移及EMT的发生。结论:TAMs可以促进肺癌的进展。第二部分:TAMs促进肺癌进展关键基因的预测目的:预测TAMs促进肺癌进展的关键基因。方法:利用GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(https://***/geo/)下载公共数据进行分析,并利用R语言进行差异表达基因热图的绘制;利用GO(Gene Ontology)分析(http://***/)来进行差异表达基因的注释和视觉化以及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,http://***/kegg/***)进行差异基因所富集的通路分析;利用STRING数据库(http://***/)来建立差异基因间的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并用Cytoscape(http://***/)来使之可视化。结果:GEO数据库公用数据分析出MCM处理组和对照组有176个差异基因,GO分析发现这些基因涵盖了强大的生物学功能,例如细胞外基质、血管生成、蛋白整合等,KEGG分析发现这些基因参与了许多信号通路,如ECM-receptor interaction、P13K-Akt、TNF、TGF-beta、MAPK、NF-κB、p53等信号通路,Cytoscape软件进行差异基因PPI(蛋白互作)分析,发现PP2Acβ、POLR2F、POLR2D、RBBP4等关键节点基因下调,PTGS2、PDGFB等关键节点基因上调。结论:预测出PP2Ac(protein phophatase 2A,PP2A,蛋白磷酸酶2A)可能是TAMs促进肺癌的进展的关键基因。第三部分:TAMs促进肺癌进展关键基因的验证目的:证实TAMs是否通过下调PP2Ac从而促进肺癌的进展。方法:免疫组化检测肺癌患者及裸鼠原位肺癌中PP2Ac蛋白水平的表达,并分析CD163与PP2Ac之间的关系;western blot方法检测肺癌细胞中PP2Ac蛋白的表达;四环素(tetracycline,Tet)诱导表达调控系统建立过表达PP2Acα的肺癌H292细胞株并建立裸鼠皮下移植瘤检测过表达PP2Acα在体内对于肺癌生长的影响;划痕实验检测过表达PP2Ac在体外对肺癌细胞迁移的影响;免疫荧光检测过表达PP2Acα对肺癌细胞EMT的影响。结果:肺癌患者标本PP2Ac与CD163表达呈负相关;MCM处理后的肺癌H292细胞PP2Ac的表达下降;过表达PP2Acα组裸鼠肿瘤明显小于对照组;过表达PP2Acα可削弱TAMs促进肺癌细胞的迁移能力及发生EMT的能力。结论:TAMs依赖于下调PP2Ac表达的方式从而促进肺癌的进展。第四部分:TAMs促进肺癌进展所涉及的关键通路目的:探讨NF-κB通路是否为参与TAMs下调PP2Ac表达从而促进肺癌进展中所涉及的关键通路。方法:免疫组化检测肺癌患者及裸鼠原位和移植瘤中CD163和p-IKK蛋白水平的表达并分析CD163与p-IKK之间的关系;western blot方法检测p-IKK、IKK蛋白的水平;利用Tet-ON诱导可调控系统建立显性负性突变体(dominant negative,DN)DN-IKKα(S176/180A)、DN-IκBα(S32/36A)的细胞株,并检测这些细胞株中PP2Ac的表达。结果:CD163和p-IKK水平呈正相关;MCM处理组p-IKK及IKK蛋白水平较对照组高;DN-IKKα(S176/180A)、DN-IκBα(S32/36A)组的肺癌细胞株中PP2Ac蛋白的表达水平较对照组低。结论:TAMs可激活NF-κB通路并可依赖于激活NF-κB通路的方式下调PP2Ac从而促进肺癌的进展。第五部分:TAMs与NF-κB/PP2Ac通路下游靶基因的生物学预测目的:探讨