基于均匀设计评价牛膝-杜仲最佳配伍干预糖皮质激素性骨质疏松症的作用

作     者：李峻昊 

作者单位：上海中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴薇薇

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：糖皮质激素 骨质疏松 牛膝 杜仲 均匀设计 斑马鱼 骨细胞 

摘      要：目的:基于均匀设计法,通过观察高浓度糖皮质激素地塞米松对斑马鱼骨骼骨矿化及成骨细胞分化的影响,探析牛膝-杜仲药对最佳配伍的干预作用;通过观察地塞米松对MLO-Y4小鼠骨样细胞的增殖、凋亡的影响,观察牛膝-杜仲药对配伍对细胞的保护作用。为牛膝-杜仲药对防治糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)提供实验依据。方法:1.采用高效液相色谱法对怀牛膝和杜仲水提物(冻干粉)进行质量评价。2.体内实验:选用5天大的野生型斑马鱼,10mol/L地塞米松(Dex)诱导建立斑马鱼骨质疏松模型。分别加入不同浓度的牛膝-杜仲(比例分别为1:3、2:2、3:1)进行毒性实验。选取小于半数致死剂量(LD)的浓度进行后续实验。根据均匀设计法2因素7水平(U*(7))的配比给药,干预96h后以茜素红染色,体式显微镜下拍照观察并计算斑马鱼脊椎骨的面积和累积光亮度,检测碱性磷酸酶(ALP)活性。观察牛膝-杜仲药对干预斑马鱼GIOP模型的作用,以Minitab软件进行多元逐步回归分析,计算得出均匀设计回归方程,并选取有显著意义的药对配比和剂量进行验证性实验。3.体外实验:MLO-Y4小鼠骨样细胞,分为对照组、模型组(10mol/L Dex)、阳性对照组(10mol/L阿仑膦酸钠,ALN)、牛膝组(10μg/m L)、杜仲组(10μg/m L)和牛膝-杜仲配伍组(10μg/m L;比例为1:1),采用CCK-8法、Annexin V-PI法进行细胞增殖、凋亡检测,观察牛膝-杜仲对模型细胞的保护作用。结果:1.怀牛膝和杜仲的质量评价:牛膝和杜仲水提物均符合《中国药典》的标准,适合做后续实验。2.毒性实验:牛膝-杜仲药对比例在2:2时的LD为300μg/m L。在相同浓度条件下,牛膝比例高,则出现死亡率高。选取小于LD的浓度进行后续实验,结果显示,不同比例的牛膝与杜仲配伍均有防治GIOP的作用,200μg/m L以下为安全范围浓度,不同浓度的牛膝与杜仲药对比例2:2的干预效果比较稳定。3.均匀设计实验:牛膝-杜仲药对对斑马鱼GIOP模型有显著的干预效果。与模型组比较,牛膝50μg/m L+杜仲50μg/m L、比例为1:1时,对斑马鱼的骨矿化和ALP活性的增加作用最明显(P0.01),效果优于单味药或ALN。4.细胞增殖、凋亡实验:与模型组比较,阳性对照组、牛膝组、杜仲组、牛膝-杜仲配伍组的MLO-Y4小鼠骨样细胞均增殖,细胞总坏死率(PI)下降。其中牛膝-杜仲配伍组的细胞增殖明显高于模型组(P0.05),细胞总坏死率明显低于模型组(P0.01)。牛膝-杜仲配伍的细胞保护作用优于单味药或ALN。结论:1.从斑马鱼GIOP模型体内实验中得出:牛膝-杜仲配伍对斑马鱼GIOP模型具有干预作用,最佳浓度为牛膝(50μg/m L)+杜仲(50μg/m L),浓度比例为1:1,与经典组方独活寄生汤中牛膝-杜仲药对配伍比例一致。2.从MLO-Y4小鼠骨样细胞GIOP病理模型体外实验中得出:牛膝-杜仲配伍对MLO-Y4小鼠骨样细胞GIOP病理模型具有保护作用。