转录辅激活因子MED1在CCl4诱导肝纤维化中的作用研究

作     者：岳少云 

作者单位：阜阳师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：屈长青;白亮

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：肝脏MED1特异性敲除小鼠 肝脏纤维化 肝星状细胞 

摘      要：目的:肝纤维化是动态和高度整合细胞对慢性肝损伤的一种反应,是肝细胞炎症引起的瘢痕组织过度堆积,最终会导致肝硬化甚至肝癌。MED1是Mediator复合物的关键成员,其与转录因子相互作用促进转录起始复合物的形成,控制Pol II的活性和延伸,参与对组蛋白密码、染色质高级结构及相分离的调控。尽管MED1在肝脏再生和脂质代谢等方面发挥着作用,但其在肝纤维化中的作用及机制尚不明确。因此,我们通过GEO数据库,对小鼠肝脏纤维化样本进行了筛查,运用GEO2R对样本进行质控、过滤及差异表达分析,并以肝脏MED1特异性敲除小鼠为模型,给予CCl刺激,构建肝纤维化损伤模型,通过H&E染色、免疫组化、RT-PCR和Western Blot等技术手段探究MED1在CCl诱导的肝纤维化中的作用及分子机制。方法:一、利用GEO数据库分析MED1在肝纤维化中的表达利用NCBI(https://www.***.nlm.***.gov/)GEO数据库,以Liver Fibrosis为关键字对基因表达数据(鼠源)进行筛选,获得(GSE55747)健康和疾病状态共计10个样本,利用GEO2R对这10个样本进行质控、过滤及差异表达分析。二、构建MED1特异性敲除小鼠肝纤维化损伤模型将MED1fl/fl小鼠与MED1小鼠杂交,获得子代小鼠,剪取3周龄尾部提取DNA,PCR检测Cre阳性(有401bp片段)表达。在第8周龄开始持续6周注射CCl,每周3次,构建肝纤维化损伤模型。三、生化与病理学检测利用AST、ALT检测肝损伤MED1和MED1fl/fl小鼠转氨酶水平,H&E染色观察肝细胞损伤及炎症状况,天狼星红和Masson观察胶原沉积,免疫组化检测肝星状细胞活化的分子标记(α-SMA)。四、分子生物学检测运用RT-PCR和Western Blot技术检测肝脏纤维化分子标记(IL-1β、TGF-β、MMPs、Colla1、TIMPs等)m RNA及FN-1、Egr1、α-SMA等蛋白表达水平。结果:一、GEO数据显示,与健康样本相比,肝脏纤维化样本中MED1及其家族成员荧光值有显著的升高(p0.01),且GO分析表明MED家族在肝纤维化中参与了细胞增殖调控。二、PCR结果鉴定表明,Cre阳性(具有401bp条带)的为MED1小鼠。小鼠腹腔最后一次注射CCl,48小时后称其体重,处死,MED1相比MED1fl/fl小鼠肝脏颜色鲜艳质地柔软表面没有坚硬颗粒,且体重差异显著(P0.01),说明肝纤维化损伤模型构建成功。三、MED1较MED1fl/fl小鼠ALT与AST水平显著降低(P0.01),说明MED1小鼠肝损伤减少。MED1小鼠HE染色未形成中央静脉周围桥性病变,肝小叶结构完整,肝细胞炎症浸润增加;天狼星红和Masson结果显示MED1小鼠胶原沉积明显降低(P0.01),表明MED1小鼠肝脏ECM积累减少,免疫组化进一步显示MED1小鼠α-SMA表达减少,说明肝星状细胞的活性被抑制,肝纤维化减轻。四、RT-PCR结果显示MED1小鼠MMP2、MMP13 m RNA表达水平显著降低,TIMP1表达减少,表明MED1缺失影响基质金属蛋白酶的表达;MED1小鼠TNFα、MIP2、Colla1的表达减少,表明MED1小鼠纤维形成减少。Western Blot结果显示TGFβ1、α-SMA和FN1的表达降低,进一步证明MED小鼠肝纤维化程度较轻。结论:在CCl诱导的肝纤维化模型中,肝脏MED1特异性缺失能够抑制HSCs的激活,减少纤维的生成,从而可减轻肝纤维化程度。