铜绿假单胞菌YY24脱氮过程中基因克隆、产气和实际应用的初步研究

作     者：李连星 

作者单位：天津农学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陈成勋

授予年度：2017年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 08[工学] 

主      题：铜绿假单胞菌 硝化反硝化 基因 凡纳滨对虾 氮气 

摘      要：氮素是水体污染中一类重要的污染物,对人体健康和环境危害极大。生物脱氮方法以其无污染、经济有效的特点被认为是最实用的污水脱氮方法。近年来,许多新发现的好氧反硝化菌和异养反硝化菌可在同一好氧池内实现同步硝化反硝化,为生物脱氮提供了新的途径。本试验主要基于养殖水环境中生物脱氮的角度,以已鉴定的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa YY24)为研究对象,从分子生物水平上研究其硝化反硝化反应的基因克隆,明确菌株YY24异养硝化-好氧反硝化过程中的控制基因;探讨不同氮源对菌株YY24的生长、除氮能力及气体产物的影响;探讨不同浓度和模式下菌株YY24对凡纳滨对虾生长及养殖水体水质的影响。首先对铜绿假单胞菌YY24的9种硝化反硝化基因进行PCR扩增、鉴定及测序。从基因水平初步探讨菌株YY24的异氧硝化-好养反硝化基因克隆。试验结果表明,铜绿假单胞菌YY24中具有控制硝化反应的氨单加氧酶基因类型amoA及控制反硝化反应的各关键酶:硝酸盐还原酶基因类型narG、亚硝酸盐还原酶基因类型nirS、一氧化氮还原酶基因类型qnorB和一氧化二氮还原酶基因类型nosZ。根据以上分析总结,我们提出了铜绿假单胞菌YY24脱氮的假想途径:NH-N→NO-N→NO-N→NO→NO→N,控制反应的关键酶分别为amoA、narG、nirS、qnorB和nosZ。使用产气装置和气体检测仪对菌株在脱氮过程中产生的气体种类和浓度进行分析,考察不同氮源对菌株YY24同步硝化反硝化以及气体产生情况的影响。试验结果表明,菌株YY24能以单一氮源进行高效异养硝化和好氧反硝化作用,120 h内分别可将303.69 mg/L铵态氮降至6.74 mg/L,去除率为97.78%;将101.89 mg/L硝态氮降至0.04mg/L,去除率为99.96%;将60.72 mg/L亚硝态氮降至16.59 mg/L,去除率为72.68%。这三种氮源都适合作为菌株YY24生长的氮源,其中以铵态氮为氮源的效果最好,最终产物都是N,未检测到NO、NO。铜绿假单胞菌YY24是一株具有较强异养硝化好氧反硝化功能的菌株,根据菌株YY24对单一氮源的脱氮中间产物分析,异养硝化脱铵过程有硝态氮的积累,无亚硝态氮的积累;好氧反硝化还原硝态氮过程有亚硝态氮的积累。通过在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖水体中添加铜绿假单胞菌YY24,探讨了水体中不同方式和不同浓度投放铜绿假单胞菌YY24对凡纳滨对虾生长及水质的影响。试验结果表明:铜绿假单胞菌YY24在凡纳滨对虾养殖水体中,具有较强的竞争能力、除氮功能和活性,且未表现出致病性。与对照组相比,各试验组存活率与增重率均显著高于对照组(P0.05);各试验组均能明显净化水质,且在同浓度下多次投放组的对虾生长均优于单次投放组,其中以G组最佳;试验组的pH呈上升趋势,各试验组NH-N、NO-N、NO-N浓度均在96 h时就达到最低值,菌株YY24的除氮效率很高,反应所需时间较短;初始投放10 cfu/ml浓度的YY24,在96 h内去除氨氮的效果较好,而每隔一天投10 cfu/ml浓度YY24的持续作用效果更好。