PUMA在幽门螺杆菌胃炎中的作用及其相关信号通路的机制研究
作者单位：南京医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：张国新
授予年度：2018年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：幽门螺杆菌（Helicobacter,***,Hp）是一种主要定植于胃内的革兰染色阴性杆菌。Hp是胃癌的I类致病因子。Hp定植是最常见的慢性胃炎的病因,Hp胃炎是消化性溃疡、胃癌等疾病发生的最重要危险因素。转录因子NF-κB（P65）是免疫和炎症反应的关键调控因子,幽门螺旋杆菌诱导之NF-κB激活已引起强烈关注,相关的研究是目前领域内的热点。P53上调凋亡调控因子（P53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA）是Bcl-2家族的成员,其隶属于BH-3 only亚家族。PUMA可通过P53和非P53途径激活表达从而诱导凋亡。各种因素可通过刺激多种转录因子调控PUMA的表达。文献报道在Hp胃炎中PUMA表达增高。我们的预实验发现:PUMA在Hp胃炎组织中高表达,而Hp可通过NF-κB转录PUMA,提示其参与Hp介导的慢性胃炎发生发展,而PUMA可能是NF-κB重要的下游分子。然而PUMA在从慢性胃炎的发生与发展过程中是诱导炎症还是抑制炎症,Hp作用下NF-κB如何调控PUMA均不明确。本研究通过细胞转染、RNA干扰、流式细胞术、转录因子调控、Western-blot、IHC、IF、PUMA基因敲除的小鼠胃炎模型等实验方法,从临床样本、动物实验和细胞三个层面进行研究来论证PUMA在幽门螺杆菌胃炎发生发展中的具体作用,并对CagA+Hp作用下,NF-κB调控PUMA的机制进行了初步的探索。本研究首先检测PUMA在Hp胃炎组织及正常对照组中的mRNA水平,结果显示Hp胃炎中PUMA mRNA显著上调。而Western blot对PUMA蛋白表达的检测显示了同样的结果。我们还对组织切片进行免疫组化检测,Hp胃炎免疫组化结果为阳性,而对照组为阴性,PUMA主要定位于细胞质中。我们还对Hp胃炎组织进行HE染色并予以悉尼评分,再将悉尼评分与PUMA的mRNA水平进行相关性分析,结果为正相关。我们认为PUMA在胃粘膜组织中的表达与胃炎的炎症程度正相关,PUMA参与慢性胃炎的发生与发展。我们还用TUNEL检测了Hp胃炎中的凋亡,结果表明Hp胃炎中凋亡显著增加。本研究中采用了PUMA基因敲除小鼠胃炎模型来验证PUMA缺失对Hp胃炎中炎症和凋亡的影响。我们应用Real-time PCR检测小鼠Hp胃炎模型胃组织中PUMA的mRNA水平,结果证明Hp可在小鼠胃炎模型中诱导PUMA上调。小鼠胃炎模型的炎症程度用HE染色来判断,我们发现PUMA是小鼠Hp胃炎发生发展的重要环节,PUMA缺失则抑制小鼠Hp胃炎。我们还运用TUNEL联合免疫荧光检测了凋亡,结果为WT+Hp组小鼠模型可见明显的凋亡,而PUMA-KO+Hp组小鼠中未见明显凋亡。最后,我们利用免疫组化检测了WT组和PUMA-KO组两组胃炎模型中的内因子和TFF1,发现两组之间存在明显差异。提示敲除PUMA有可能减轻萎缩。总而言之,PUMA参与了小鼠Hp胃炎的发生发展,且是Hp诱导Hp胃炎的重要环节;PUMA诱导的凋亡与Hp胃炎密切相关。而PUMA有望成为Hp胃炎治疗的药物靶点,PUMA抑制剂等有望成为新的Hp胃炎治疗药物。我们用不同的胃癌细胞系与Hp共培养,发现Hp在这4种细胞系中均可诱导PUMA蛋白表达,而不论其是否为p53突变株。这证明了Hp对PUMA的诱导是不依赖于p53的,PUMA是Hp诱导的凋亡的重要环节,与我们实验预期一致。我们选择了AGS细胞系（包括WT和PUMA-KO）与Hp共培养,并进行CCK8,发现Hp可以抑制AGS WT的增殖,但在PUMA-KO的AGS中,Hp并不能抑制细胞增殖。接下来我们利用AnexinV-FITC/PI在流式细胞仪上检测凋亡,发现Hp可以诱导AGS WT凋亡,但是并不能诱导PUMA-KO的AGS凋亡。我们还检测了PUMA下游的一些凋亡相关蛋白,Hp在AGS中可诱导凋亡蛋白表达,如果敲除了PUMA,则这些凋亡蛋白不能表达。以上结果表明Hp可以抑制AGS增殖,并且诱导AGS细胞凋亡,与文献报道一致,这些证据均表明PUMA是Hp诱导AGS细胞凋亡的重要环节。为进一步明确Hp通过NF-κB诱导PUMA表达上调的机制,我们选择AGS来进一步研究。首先,应用Hp与AGS共培养后,我们确定Hp可以诱导p65、p65磷酸化以及PUMA表达,并且确定了最适宜时间点。我们利用不同分组检测核提取蛋白,结果显示Hp可以诱导p65核易位,与阳性对照TNF-α类似;加用Bay11-7082后,Hp诱导的p65核易位被抑制。接下来,我们仍使用上述分组检测胞质蛋白,结果显示Hp与TNF-α可以诱导胞质中的PUMA表达,而加用Bay11-7082后,Hp诱导的PUMA可被Bay11-7082所抑制。至此我们可以证明Hp通过NF-κB诱导PU
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