鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株与母细胞株lncRNA的差异表达谱分析
作者单位：昆明医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：熊伟
授予年度：2020年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
主 题：鼻咽癌细胞 同期放化疗抵抗 lncRNA 高通量测序
摘 要：[目的]通过体外构建鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗模型,诱导鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗细胞株,利用高通量测序方法,对比同期放化疗抵抗细胞株和母细胞株lncRNAs的差异表达,筛选参与鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗的lncRNAs,并应用生物信息学分析差异表达的lncRNAs靶基因参与的GO条目和KEGG信号通路,为进一步探索鼻咽癌同期放化疗抵抗机制奠定基础。[方法]1、构建体外鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株。选取鼻咽癌高分化细胞CNE1和低分化细胞CNE2,暴露于浓度为0.05ug/ml的顺铂完全培养基中,并予6Gy的6Mv X-ray照射,细胞接触顺铂至24小时后予更换新鲜培养基,待残余细胞恢复生长后重复上述处理,共10次,得到鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株,分别命名为 CNE1CRR 和 CNE2CRR。2、利用克隆形成法验证细胞同期放化疗抵抗性。将1步骤中得到的同期放化疗抵抗细胞株及其母细胞株分别接种300、400、800、1000、2000、4000个细胞于6孔板中,并暴露在0.05ug/ml浓度的顺铂完全培养基中,室温下分别予0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy梯度剂量的X射线照射,细胞接触顺铂至24小时,更换新鲜完全培养基,继续培养2周,甲醇固定细胞,结晶紫染色,显微镜下计数大于50个细胞的克隆团,计算每个剂量下细胞的生存分数,应用单击多靶模型拟合生存曲线,并计算SF2、D0、Dq值。3、筛选参与鼻咽癌同期放化疗抵抗的lncRNAs。基于全转录组的高通量测序方法检测放化疗抵抗细胞株和母细胞株中lncRNAs的差异表达。4、对差异表达lncRNAs的靶基因进行功能富集分析。应用生物信息学软件预测差异表达lncRNAs的靶基因,基于基因本体论（Gene Ontology）数据库注释,探索lncRNAs靶基因参与的GO条目;基于京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）数据库注释,探索 lncRNAs 靶基因相关的信号通路。5、qRT-PCR验证lncRNAs差异表达谱。随机选取4个lncRNAs（两组细胞中同时差异表达）,qRT-PCR检测其在鼻咽癌同期放化疗抵抗细胞株和母细胞株中的表达情况,并对比PCR结果与测序结果趋势是否一致。6、数据统计分析。采用SPSS25.0进行,数据以均数±标准差（x±s）表示,组间资料用配对t检验进行统计分析。[结果]1、经过10次体外同期放化疗处理后,建立了同期放化疗抵抗细胞株CNE1CRR 和 CNE2CRR;2、应用克隆形成法证实了 CNE1CRR和CNE2CRR对同期放化疗的抵抗性;3、通过高通量测序,筛选出2746个lncRNAs在CNE1CRR和CNE1中差异表达（其中358个显著上调,2063个显著下调）;3475个lncRNAs在CNE2CRR和CNE2中差异表达（其中CNE2CRR中显著上调265个,520个显著下调）;此外,387个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中表达同时下调,49个lncRNAs在CNE1CRR和CNE2CRR中同时上调;4、对差异表达lncRNAs的靶基因行功能富集分析。在GO分析中,从生物进程（Biological process）、细胞构成（Cellular component）、分子功能（Molecular function）三个方面对差异表达lncRNAs靶基因参与的GO条目进行分类,发现lncRNAs靶基因参与多种生物学功能;KEGG信号通路分析中,发现差异lncRNAs靶基因参与多种信号通路;不同的基因可参与同一信号通路;同一基因可参与不同的信号通路。5、qRT-PCR对lncRNAs差异表达谱的验证结果。qRT-PCR结果显示LOC102724699、LOC102724872、AC002116.7三个 lncRNAs 在 CNE1CRR 和CNE2CRR中表达同时上调;HNRNPU-AS1在CNE1CRR和CNE2CRR中表达同时下调;qRT-PCR的表达趋势与测序的表达趋势基本一致,表明本次测序结果具有可靠性。[结论]1、本实验成功构建了鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗细胞株CNE1CRR、CNE2CRR,为鼻咽癌同期放化疗抵抗的机制研究奠定基础;2、获取了参与鼻咽癌细胞同期放化疗抵抗的lncRNAs差异表达谱,并通过生物信息学分析,得到了差异表达lncRNAs靶基因可能作用的生物学功能和信号通路,对后续同期放化疗抵抗机制研究具有指导意义。
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