双酶转化富马酸生产β-丙氨酸的研究

作     者：钱园园 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘立明

授予年度：2020年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：β-丙氨酸 L-天冬氨酸酶 L-天冬氨酸α-脱羧酶 蛋白质工程改造 级联反应 

摘      要：β-丙氨酸是天然存在的唯一β-型氨基酸,是辅酶A和泛酸等功能性化合物合成的前体。和传统化学合成法相比,以L-天冬氨酸为底物的酶转化法反应温和、转化率高,是目前最受关注的β-丙氨酸生物制备方法之一。但是其关键酶L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)存在严重的机制性失活,且底物价格昂贵,限制了规模化生产。本研究发展了以廉价的富马酸为起始底物,通过偶联PanD和L-天冬氨酸酶(AspA)催化富马酸生成β-丙氨酸的工艺路线。通过蛋白质工程改造,提高PanD的催化稳定性,进一步结合蛋白表达调控策略,优化共表达菌株双酶表达水平,使AspA和PanD具有良好的协同性,显著提高了级联路径的转化效率。主要研究结果如下:(1)设计、构建与验证了级联生产β-丙氨酸的路径。首先,筛选到Bacillus subtilis来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶(BsPanD)和Escherichia coli来源的L-天冬氨酸酶(EcAspA)作为级联反应的路径酶;其次,体外反应检测到产物β-丙氨酸的生成,验证了该级联路径的可行性;最后,通过体内转化反应,鉴定了PanD存在严重的机制性失活现象,导致催化稳定性差,是该级联反应的限速酶。(2)蛋白质工程改造BsPanD缓解机制性失活。根据PanD失活途径,提出增加质子化过程中错误加氢距离提高催化稳定性的猜想;基于该猜想,将构象动力学和结构比对方法相结合,筛选获得I46V和K104S有益突变位点,进一步通过C末端删除策略以及文献挖掘分别引入I126*和I88M两个突变位点,获得最优突变体Q5(BsPanDI46V/I88M/K104S/I126*),转化L-天冬氨酸生成的β-丙氨酸产量达到98.0 g·L-1,是野生型Q0的2.58倍;动力学参数表明,Q5与Q0相比,全细胞反应以及体外纯酶反应的催化半衰期分别提高了248%和164%,总转换数TTN提高了152%;分子动力学模拟表明,Q5与Q0相比,错误加氢的距离由4.9?延长至5.5?,且突变体蛋白的整体稳定性提高,蛋白内部的氢键相互作用增强,有利于正确加氢反应的进行。(3)体内双酶组装合成β-丙氨酸。将BsPanD突变体Q5与EcAspA偶联,构建共表达菌株pBsPA,利用全细胞转化验证了体内级联反应的可行性。然而,AspA与PanD较大的酶活差异(26:1)使路径中两步反应失衡,中间产物L-天冬氨酸过量积累;体外实验表明,控制两酶的酶活比例在1.0:1-1.5:1,β-丙氨酸产量最高;基于体外优化结果,使用RBS调控策略降低AspA表达水平,两酶的酶活比例降低到4.6:1;进一步利用基因重复表达策略提高PanD表达水平,获得pBs3PA-1菌株,酶活比例降低到1.3:1,达到最佳范围;5 L发酵罐对pBs3PA-1的发酵产酶和转化条件进行优化,确定最适发酵条件为:接种量5%,细胞生长至OD600为3后加入5 g·L-1乳糖,25°C诱导14 h,最适转化条件为:转化温度37°C,转化pH 6.5,添加1 g·L-1曲拉通和20 g·L-1全细胞催化剂;该反应在最优条件下放大到15 L发酵罐,实现转化156.4 g·L-1富马酸,β-丙氨酸产量达到118.6 g·L-1,单位细胞的β-丙氨酸生产能力为5.9 g·g-1湿菌体,转化率99%。