水稻类病斑突变体oshpl3和lmla1的鉴定与遗传分析

作     者：涂燃冉 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：沈希宏

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻 类病斑突变体 遗传分析 基因定位 抗病性 

摘      要：植物类病斑突变体会自发表现出类似过敏反应(HR)斑点和自发激活体内免疫反应。本研究经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变长粒粳稻品系CG3(WT)获得两个类病斑突变体oshpl3和lmla1,重点开展突变体表型分析、抗性鉴定以及候选基因定位等方面的研究,为进一步探索植物免疫或抗性形成机制提供借鉴。1、突变体oshpl3在播种后7天植株叶片上开始随机出现白色小斑点,后期逐渐转变成大的褐色斑点。主要农艺性状考查发现,除穗长外,突变体oshpl3中株高、有效穗数、总粒数、结实率、千粒重和单株产量等均显著低于野生型(WT)。无菌条件下,突变体oshpl3的斑点能够自发形成。伊文思蓝染色和TUNEL实验显示,与WT相比,突变体oshpl3叶片存在大量的细胞死亡,同时DAB染色显示其HO过量积累,并伴随超氧化物歧化酶(SOD)活性升高、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低以及HO和丙二醛(MDA)含量升高。病原菌模式分子flg22和chitin处理显示,相对于WT,突变体oshpl3中活性氧(ROS)积累速率明显高于WT且一直呈现升高趋势。白叶枯接种实验表明,突变体oshpl3表现出对白叶枯病菌抗性,且其PR相关基因和JA相关基因表达量在接种前后均高于WT。遗传分析结果显示,突变体oshpl3表型受一对隐性核基因控制,并且通过图位克隆的方法将突变体基因精细定位于2号染色体短臂位于标记SID40-6和SID-8之间51.4 kb物理区间内,该区间包含10个ORF。测序后发现,突变体中候选基因OsHPL3发生G1006A突变,从而导致在OsHPL3蛋白跨膜区第295个氨基酸G变为D。亚细胞定位表明,OsHPL3蛋白定位于叶绿体、细胞质和一个未知的细胞器。根据我们的研究结果,认为突变体oshpl3类病斑表型和白叶枯病菌抗性增强与其ROS过量积累及PR基因和JA信号激活密切相关,且OsHPL3最有可能导致突变体oshpl3表型,同时这一结果也能为研究OsHPL3蛋白功能提供新线索。2、叶尖类病斑突变体lmla1,播种后40天,植株老叶上能明显观察到红棕色斑点,且叶尖部位发生枯萎。红棕色斑点出现在叶片枯萎之前,且该表型由老叶逐渐向新叶发展。农艺性状考查发现,除结实率外,突变体lmla1中株高、有效穗数、穗长、总粒数、千粒重和单株产量等重要农艺性状均极显著低于WT。组织化学分析结果显示,与WT相比,突变体lmla1存在大量细胞死亡和HO过量积累,且突变体叶片中SOD活性极显著上升,CAT和POD活性则显著下降,HO和MDA含量极显著升高。遗传分析表明,突变体lmla1表型受一对隐性核基因控制。通过图位克隆方法,将候选基因精细定位于第1号染色体长臂56.8 kb区间内,该区间含有11个候选基因。我们研究结果表明突变体lmla1表型依赖于植株发育进程,且与细胞死亡、ROS过量积累及其他因素有关,同时为克隆OsLMLA1奠定了坚实的基础。