特异性过氧化亚硝酸盐荧光探针的制备与应用

作     者：李子璐 

作者单位：济南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱宝存

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 0804[工学-仪器科学与技术] 

主      题：荧光探针 过氧化亚硝酸盐 光谱分析 生物成像 

摘      要：在天然水体中,过氧化亚硝酸盐(ONOO)可以通过氧化和硝化反应途径直接降解几类溶解性有机物(DOM),因此它在降解DOM的过程中具有重要的作用。而在人体中,过氧化亚硝酸盐是内源性产生的活性氧(ROS)之一,不仅在信号转导中发挥着必不可少的作用,也在生物系统中具有抗菌的作用。但是它也可以破坏活细胞中的各种分子,据报道体内异常水平的过氧化亚硝酸盐与许多人类疾病相关,例如癌症等。然而,由于过氧化亚硝酸盐具有活泼性、半衰期短、高反应性等性质,在生命和环境系统中的相关作用尚未完全阐明。因此,寻找到一种能够在环境和生命中分析过氧化亚硝酸盐的方法是非常重要的,不仅对于更好地了解其生物学作用具有重要意义,还可以用于相关疾病的早期诊断。在众多检测方法中,小分子荧光探针因其操作简便、选择性高、无创性以及动态实时观察而备受关注。在过去的几年中,已经开发出许多荧光探针用于检测过氧化亚硝酸盐,但大多数已报道的过氧化亚硝酸盐荧光探针仅在单个波长上显示荧光变化,这使得它们受到许多因素的影响,而比率型荧光探针是可以消除这些因素的影响,从而使分析结果更加准确。此外,许多探针表现出某些缺点,例如发射波长短、响应时间长、选择性较差、以及灵敏度较低,这都会限制它们在生物成像中的应用。因此,为了能够提供有价值的能够检测过氧化亚硝酸盐的工具,开发比率型荧光探针,或具有快速响应、高选择性、高灵敏度、长发射波长的荧光探针具有重要意义。基于此,本论文设计并合成了三例新型过氧化亚硝酸盐荧光探针,并在活细胞水平或者在活体水平上实现了生物成像。基于罗丹明衍生物荧光团和酰肼反应基团,开发了一种发射红光的长波长比色荧光探针Red-PN,用于过氧化亚硝酸盐的检测和成像。与其它活性氧/活性氮(RNS)相比,该探针显示出对过氧化亚硝酸盐的高灵敏度和特异性,并且探针溶液反应前后具有明显的颜色变化(由无色到粉红色),因此可以利用该探针裸眼检测过氧化亚硝酸盐。此外,该探针对细胞具有低毒性,并已成功用于检测RAW 264.7细胞和斑马鱼中的外源性和内源性过氧化亚硝酸盐。基于香豆素-吡啶衍生物荧光团和硼酸盐识别基团,设计并合成了一种比率型过氧化亚硝酸盐荧光探针CPD-ratio。探针自身的发射峰在565 nm,当探针与过氧化亚硝酸盐反应后,将诱导苄基保护基从探针上裂解,释放出荧光团,从而发射峰蓝移至500 nm处,实现了对过氧化亚硝酸盐的比率检测。探针CPD-ratio具有快速响应(30 s)、选择性高、灵敏度高的优点,最后已有效的用于RAW 264.7细胞中内源性和外源性过氧化亚硝酸盐的比率成像。以双香豆素BC-dye作为荧光团,把硼酸酯作为特异性识别基团,合成了新型荧光探针BC-PN。探针BC-PN具有许多优异的性能,例如能够特异性地检测过氧化亚硝酸盐,具有出色的灵敏度(检测限为4 nM),并且可以迅速响应过氧化亚硝酸盐。使用这种简单的荧光探针,我们实现了在活细胞和斑马鱼中内源性和外源性过氧化亚硝酸盐的检测。此外,BC-PN通过成像不同细胞中的基底过氧化亚硝酸盐,已有效地区分了癌细胞和正常细胞。