马梨形虫病三种核酸检测方法的建立

作     者：刘铮 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈启军

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：马梨形虫病 马泰勒虫 驽巴贝斯虫 巢式PCR 

摘      要：马梨形虫病是一种由马泰勒虫(Theileia equi)和驽巴贝斯虫(Babesia caballi)寄生于马属动物血液红细胞的血液原虫病。临床症状主要为溶血性贫血、黄疸,症状严重时可造成患畜死亡。本病曾被列为中国二类动物疫病,目前是国际动物卫生组织(OIE)必须报告的疾病之一。感染梨形虫病的马匹如果未能及时诊断治疗,则会对养马业造成重大损失。目前,世界各国虽然在马梨形虫病的诊断新方法进行了大量的研究探索并取得了一定的成果,但仍需要一种敏感性高、特异性强并可再临床大规模推广的诊断方法。本研究在查阅了大量的马梨形虫病诊断及鉴定文献后,将研究目标确定在巢氏PCR核酸检测方法的建立上。根据Gen Bank中的T.equi 18S r RNA及B.caballi 18S r RNA保守序列设计了2组引物,通过对试验方法进行不断调整优化,并进行特异性、灵敏性试验,最终建立了马梨形虫病巢式PCR检测方法。结果显示,本试验所建立的马梨形虫病巢式PCR检测方法可特异地检测出T.equi和B.caballi的单独标准阳性样本及混合样本,具有良好的特异性和敏感性,牛中华泰勒虫均无反应,但在临床实际样本的检测中无法区分是T.equi感染还是B.caballi感染。鉴于这种情况,本试验又设计了马梨形虫病双重荧光定量PCR检测方法及马梨形虫病RPA检测方法,目前这两种方法的模拟质粒试验显示可特异性的区分T.equi或B.caballi感染。本研究建立的马梨形虫病巢式PCR检测方法可以对马梨形虫病进行快速的检测,双重荧光定量PCR检测方法及RPA检测方法可对梨形虫阳性的样品进行虫种分型鉴定,综合应用多种方法进行马梨形虫的鉴定具有较强的应用价值。