OCT4通过紧密连接通路影响人毛囊间充质干细胞红系造血的机制研究

作     者：余小珍 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈桦

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：毛囊间充质干细胞 OCT4 紧密连接通路 红细胞生成 

摘      要：目的:检测细胞形态、大小、粘附性的改变,对不同细胞亚型的转录组进行测序,富集分析差异表达基因的功能,并分析OCT4下游靶基因的表达及功能,揭示人毛囊间充质干细胞（human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）中形态与粘附、多潜能性和造血之间的关联,阐明OCT4重编程的hHFMSC中红细胞生成的可能分子机制,为体外生成红细胞的研究提供新的思路。方法:①在细胞培养过程中收集含有悬浮细胞的上层培养液并离心,以分离贴壁细胞与悬浮细胞,于相差显微镜及荧光显微镜下观察细胞形态。②利用流式细胞术检测细胞前向散射,比较细胞的相对大小;通过细胞分离实验和细胞粘附实验分别检测细胞-细胞、细胞-细胞外基质粘附力的相对大小。③用RNA测序技术分析各组细胞转录本的差异并筛选差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,同时结合文献筛查OCT4下游靶基因的表达情况。④通过GO功能富集及KEGG信号通路富集计算,分析DEG的生物功能,并根据KEGG数据库注释TJ信号通路中的DEG。⑤qPCR和Western blot验证TJ通路基因、细胞骨架基因和造血基因的表达,包括TJPs、CLDNs、JAMs、ACTN2、E-cadherin、和 RUNX1 等。⑥通过 STRING 数据库对TJ通路主要成员基因、多潜能相关基因及造血相关基因之间的相互作用关系进行可视化并构建调控网络图。结果:①OCT4转导hHFMSC后出现悬浮细胞亚群,与贴壁细胞相比形态变圆、体积小、粘附性低。②转录组测序显示两种细胞亚群基因转录本具有显著差异,功能富集分析发现多潜能基因表达上调,悬浮细胞中部分多潜能基因表达相对于贴壁细胞下调,表明OCT4转导使hHFMSC去分化并获得一定的多潜能性,而悬浮细胞的多向分化潜能可能有所降低。③多潜能相关OCT4靶基因表达显著上调,而悬浮细胞中部分造血相关OCT4靶基因表达上调,上调基因显著富集于红系分化相关的生物过程,表明悬浮细胞丢失部分多潜能性,获得一定倾向造血分化的能力。④转导OCT4后下调基因显著富集于细胞连接、紧密连接（tight junction,TJ）通路、粘附和细胞骨架相关信号通路;悬浮细胞中形态、粘附相关基因和TJ通路基因表达下调更为显著。⑤qPCR和Western blot检测TJ通路基因TJPs、CLDNs、JAMs的表达,结果与测序数据一致（除TJP1外）;细胞骨架基因ACTN2和粘附基因E-cadherin在不同细胞亚群中的表达发生动态变化。⑥构建可视化基因调控网络揭示,OCT4重编程的hHFMSC通过TJ通路调节细胞形态和粘附性,其中TJP1通过KLF4、RUNX1影响多潜能的维持及造血分化之间的平衡。结论:OCT4调控hHFMSC中下游多潜能及造血相关靶基因表达,并通过TJ通路影响细胞形态和粘附,从而调控hHFMSC的多潜能性和造血分化之间的平衡。意义:本研究阐明OCT4重编程的hHFMSC通过TJ通路和下游靶基因表达调节红系分化潜能,为hHFMSC作为红细胞生成的新来源,能够在体外获得大量可扩增的造血潜能细胞并用于个体化治疗提供实验基础。