半胱氨酸脱巯基酶LCD在番茄果实成熟衰老进程中的调控机制研究

作     者：张晓玥 

作者单位：合肥工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡康棣

授予年度：2020年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：番茄 果实成熟衰老 L-半胱氨酸脱巯基酶 核定位 硫化氢 

摘      要：番茄是全球重要的经济作物,其果实含有丰富的营养成分。近年来,在延缓采后番茄果实成熟衰老和延长果实货架期等方面的研究十分深入。硫化氢(HS)是植物中广泛存在的小分子信号物质,采后果实的成熟衰老进程可以通过外源HS的处理而得到延缓。L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfhydrase,LCD)是番茄果实中生成内源HS的关键酶,本文通过对植物中LCD基因家族进行生物信息学分析,利用大肠杆菌原核表达系统验证番茄LCD蛋白的酶学性质,利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)和Crispr/Cas9基因编辑技术,构建Sl LCD1基因沉默和基因突变植株,探究Sl LCD1在番茄果实成熟衰老进程中的功能及作用机制。通过生物信息学分析,在17个植物物种中鉴定出41个LCD基因成员,利用转录组数据分析出植物LCD基因在干旱、低温和高盐等胁迫条件下有一定的响应作用。利用大肠杆菌原核表达系统,验证了番茄LCD1和LCD2蛋白具有催化L-Cys生成HS的酶学功能。通过构建亚细胞定位载体,发现番茄LCD2蛋白定位于叶绿体中,LCD1蛋白定位于细胞核中,并验证出LCD1蛋白上的NLS(核定位信号序列)与核输入蛋白importinα3相互作用,介导LCD1蛋白的细胞核定位。利用VIGS和Crispr/Cas9技术,构建了番茄Sl LCD1基因沉默植株vigs-lcd1和基因编辑T2代纯合突变植株lcd1-7和lcd1-9,发现vigs-lcd1植株的果实出现提前成熟的表型,lcd1-7/9出现植株矮小、果实提前成熟的表型。突变株果实在成熟过程中类胡萝卜素大量积累、叶绿素含量显著减少,类胡萝卜素合成相关基因(PDS、PSY1和ZDS)、叶绿素降解相关基因(NYC1、PAO、PPH和SGR1)、细胞壁代谢相关基因(CEL2、EXP、XTH5、PG和TBG4)和乙烯合成代谢途径相关基因(ACO1、ACO3、ACS2、RIN、NOR、E4和E8)的转录水平显著上调。综上所述,实验结果表明番茄LCD1和LCD2蛋白分别定位于细胞核和叶绿体中,其中LCD1是番茄内源硫化氢的主要生成酶。利用番茄基因沉默植株vigs-lcd1和基因突变株lcd1-7/9,进一步证明Sl LCD1通过色素积累、细胞壁降解和乙烯合成及响应等途径调控番茄果实成熟衰老,本研究结果为番茄果实发育和提升番茄果实品质提供了一定的理论依据。