运动调控外周NPY表达对动脉粥样硬化影响的机制研究
作者单位：中国人民解放军陆军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：宋治远
授予年度：2020年
主 题：动脉粥样硬化 神经肽Y 运动 巨噬细胞 基质金属蛋白酶8 细胞迁移
摘 要：研究背景随着人们生活水平的不断提高,动脉粥样硬化性心血管病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)已经成为目前威胁人类健康的主要疾病之一。大量研究表明,有规律的体育锻炼可以有效防治ASCVD的发生发展。然而,运动抗动脉粥样硬化作用的分子机制尚不完全清楚。神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一种36-氨基酸残基肽,广泛分布于所有支配心血管系统的交感神经中。NPY除了起源于神经元外,还可在多种血管细胞中合成和释放,包括内皮细胞(endothelial cells,ECs)、免疫细胞和巨核细胞/血小板。既往研究发现NPY及其受体参与动脉粥样硬化的进展,可引起血管收缩,促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖和肥大,刺激血管内皮细胞增殖和向毛细血管样管分化。此外,NPY还参与了巨噬细胞的活化,促进炎症因子的释放,调节巨噬细胞的粘附与迁移。这些作用均可加重动脉粥样硬化的进展。研究表明,与正常血管组织相比,NPY及其受体在人和动物的动脉粥样硬化斑块中表达明显增高。大量证据表明运动可以改变心血管系统的交感神经兴奋性,而交感神经正是外周NPY的主要来源之一。此外,运动改变大脑和外周NPY表达的作用也得到了证实。因此,我们推测运动的抗动脉粥样硬化作用与改变外周NPY的表达有关。为验证上述假设,我们选用ApoE小鼠,并喂食高脂肪食物建立动脉粥样硬化小鼠模型。同时,用不同的运动模式进行干预,以观察运动对NPY表达及动脉粥样硬化斑块的影响。同时采用体外细胞实验,探讨NPY影响巨噬细胞迁移的作用及机制,以进一步验证动物实验结果。目的1.观察运动抑制ApoE小鼠动脉粥样硬化斑块的形成是否是通过改变NPY相关通路来实现的。2.探讨NPY对巨噬细胞迁移的作用及机制。方法1.运动对小鼠动脉粥样硬化的影响及其机制研究ApoE小鼠被喂食高脂肪食物,并被随机分为高频次运动组、低频次运动组和不动组。在整个运动干预过程中,高频次运动组的小鼠每周运动5天,低频次运动组的小鼠每周运动1到2天,而不运动对照组的小鼠不进行运动干预。运动干预8周后,收集血清检测血脂及NPY的表达水平。收集的全主动脉,一部分使用油红O试剂检测整体斑块水平,另一部使用实时定量聚合酶连锁反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测动脉中NPY及其受体和相关炎症因子mRNA的表达水平。通过组织学和形态学分析测量主动脉根部斑块的形成及其稳定性。苏木素-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色、油红O染色、Masson染色分别用于检测主动脉根部的斑块形成、脂质沉积及胶原蛋白的含量。同时,用免疫组化检测巨噬细胞、平滑肌细胞、NPY及Y1受体在斑块中的含量。2.NPY影响巨噬细胞迁移的作用机制研究体外培养Raw264.7巨噬细胞系,分别给予磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)和不同浓度的NPY进行干预,24h后通过qRT-PCR及蛋白质印记(western blot,WB)检测基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8,MMP-8)的表达水平。为了进一步探究NPY促进巨噬细胞合成MMP-8的机制,我们分别采用NPY受体拮抗剂及ERK1/2受体拮抗剂和NPY一起干预Raw264.7细胞。并用qRT-PCR检测MMP-8 mRNA的变化,WB检测MMP-8、P-ERK1/2和T-ERK1/2的表达。此外,细胞迁移实验用于检测NPY对巨噬细胞迁移的影响。结果1.运动可减缓动脉粥样硬化斑块的形成,增强斑块的稳定性运动可以抑制ApoE小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。同时,运动能够减少主动脉根部斑块中巨噬细胞及脂质的含量,增加平滑肌及胶原蛋白的含量,从而提高动脉粥样硬化斑块的稳定性。然而,在此次研究中我们发现高频次运动组与低频次运动组在缓解动脉粥样硬化斑块形成及提高斑块稳定性上并没有显著差异。此外,运动并没有改善高脂饮食条件下ApoE小鼠的体重、血糖及血脂水平。2.运动抑制ApoE小鼠动脉粥样硬化斑块进展的作用与改变NPY相关通路有关血清ELISA实验证实规律运动组及偶然运动组明显减少血清NPY的含量。有趣的是,血中NPY的表达水平与斑块负荷有显著的相关性。qRT-PCR的结果也证实运动可以下调动脉血管中NPY及其受体mRNA的表达水平。此外,免疫组化的结果显示在两个运动组中NPY及Y1受体在斑块中的表达水平也出现明显的下调,特别是在巨噬细胞高表达区域。运动还可以减少动脉血管中炎症因子的表达水平。已有研究表明,NPY可以通过Y1受体调节巨噬细胞炎症因子的释放,再结合前述的结果,我们可以猜测运动能够通过减少巨噬细胞NPY及Y1受体的表达,从而抑制斑块中炎症因子的表达,抑制动脉粥样硬化的进展。3.NPY促进巨噬细胞迁移NPY能促进Raw264.7细胞MMP-8 mRNA和蛋白的表达,并有明显的剂量效应关系。这个作用可被Y1受体拮抗剂和ERK1/2抑制剂所抑制。NPY促进ERK1/2通路的激活,而这亦能被Y1受体拮抗剂所抑制。此外,NPY能促进Raw264.7细胞穿过I型胶原蛋白增加细胞迁移。同样的,Y1受体拮抗剂、ERK1/2抑制剂和金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)能够减弱NPY的促迁移作用。结论1.运动可抑制动脉粥样硬化斑块形成,提高斑块稳定性。而在高脂饮食条件下,高频次运动与低频次运动在抗动脉粥样硬化作用上无显著差异。2.运动可通过抑制外周NPY及其受体的表达,下调斑块内巨噬细胞表面Y1受体的表达,抑制巨噬细胞的激活,从而减少斑块内炎症因子的表达,延缓斑块的形成与发展。3.NPY通过激活Y1受体,增加ERK1/2的磷酸化,促进Raw264.7细胞合成MMP-8,降解细胞外基质,从而促进Raw264.7细胞迁移。
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