LincRNA-Cox2在调控宿主抗单核细胞增生李斯特菌感染中的作用及其机制
作者单位：江苏大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈盛霞
授予年度：2020年
学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学]
主 题：lincRNA-Cox2 STAT3 细胞迁移 吞噬 NF-κB P65
摘 要：目的:随着基因检测技术的发展,大量研究表明lncRNA可调控机体多项生理病理功能。本研究通过体外和体内模型探讨lincRNA-Cox2在调控宿主抗单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）感染中的作用及其机制。方法:1.建立Lm感染RAW264.7细胞模型,qRT-PCR和ELISA检测Lm感染RAW264.7 细胞后 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α的水平,FCM 检测 Lm 感染RAW264.7细胞后细胞表面标记,qRT-PCR筛选差异表达的lncRNA。***探针检测RAW264.7细胞中lincRNA-Cox2的定位并设计siRNA敲低lincRNA-Cox2,Transwell小室检测RAW264.7细胞迁移功能,平板涂布实验检测RAW264.7细胞吞噬功能,CCK8检测RAW264.7细胞增殖,qRT-PCR和ELISA检测炎症因子水平,FCM检测lincRNA-Cox2低表达对RAW264.7细胞表面标记及凋亡的影响,Western Blot检测lincRNA-Cox2低表达对RAW264.7细胞凋亡蛋白的影响。*** Blot、ELISA 和 C188-9 抑制剂研究 lincRNA-Cox2 低表达导致RAW264.7细胞功能改变的机制,免疫荧光和共定位检测lincRNA-Cox2敲低对NF-κB P65入核的影响和lincRNA-Cox2与NF-κB P65的作用方式。4.C57B/6小鼠尾静脉注射Lm菌液,感染24 h后摘眼球取血并断颈处死,分离小鼠肝、脾、脑组织。ELISA检测小鼠血浆中炎症因子水平,qRT-PCR检测小鼠PBMCs及组织中lincRNA-Cox2表达水平,革兰染色和PCR检测Lm在小鼠组织中的定殖,Western Blot检测小鼠组织中IL-6/JAK3/STAT3和NF-κB P65蛋白水平。结果:***感染导致RAW264.7细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的转录和分泌水平升高,IL-10转录和分泌水平改变无统计学意义;FCM结果表明Lm感染使RAW264.7细胞CD80和MHCⅡ表达升高,CD86无明显改变;qRT-PCR结果表明Lm感染导致RAW264.7细胞中lncRNA差异表达,其中lincRNA-Cox2表达随感染时间延长上升,在6h表达水平最高。***探针实验表明lincRNA-Cox2定位于RAW264.7细胞的胞质和胞核,主要在胞质中;Lm感染可致lincRNA-Cox2向胞核转位;lincRNA-Cox2 siRNA-1009可有效抑制lincRNA-Cox2的表达。LincRNA-Cox2低表达可抑制RAW264.7细胞的迁移功能并促进细胞对Lm的吞噬,但对RAW264.7细胞增殖、周期和表面标记的影响无统计学意义。qRT-PCR和ELISA结果表明lincRNA-Cox2敲低可抑制Lm感染引起的IL-1β、IL-6和TNF-α的升高,FCM和Western Blot检测结果显示lincRNA-Cox2低表达可下调Lm感染引起的RAW264.7 细胞中 Caspase3 活化。*** Blot和ELISA结果表明:lincRNA-Cox2不参与调控细胞中p38MAPK和ERK1/2通路,可调控IL-6/JAK3/STAT3通路;STAT3低表达可抑制细胞迁移功能,促进细胞吞噬功能。免疫荧光结果表明lincRNA-Cox2低表达可抑制Lm感染引起的RAW264.7细胞中NF-κB P65活化以及NF-κB P65入核,lincRNA-Cox2和NF-κB P65在细胞内定位相同。***感染的C57B/6小鼠外周血中促炎细胞因子表达升高。革兰染色和PCR琼脂糖凝胶电泳结果表明Lm感染24 h后菌体可存留在PBMCs中,并定殖于肝、脾、脑组织。qRT-PCR结果显示小鼠PBMCs及组织中lincRNA-Cox2表达升高,肝组织中升高最明显。Western Blot结果显示Lm感染导致小鼠组织中IL-6/JAK3/STAT3和NF-κB P65表达及磷酸化水平升高,肝组织中升高最明显。结论:Lm感染使RAW264.7细胞中lincRNA-Cox2表达升高,lincRNA-Cox2可调控细胞炎症反应,通过与IL-6/JAK3/STAT3相互作用,影响细胞迁移、吞噬,也可与NF-κB P65相互作用调控NF-κB P65入核。同时,小鼠体内实验得到验证。
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