超级增强子在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的潜在功能研究

作     者：黄智杰 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵建江

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：超级增强子 人骨髓间充质干细胞 成骨分化 生物信息学分析 

摘      要：目 的超级增强子（Super-enhancers,SEs）是具有转录活性增强子的一个大簇,不仅可以驱动控制细胞身份基因的表达,还可以用来解释细胞类型特异的表达模式,在发育生物学、癌症等疾病致病机理研究中有着巨大的应用潜力。然而,其在人骨髓间充质干细胞成骨（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）分化过程中的潜在功能及调控机制尚未见研究。本研究旨在研究参与人骨髓间充质干细胞成骨分化的超级增强子及其调控的靶基因的潜在功能。方 法购买三组原代hBMSCs并进行扩增培养。用成骨培养基对hBMSCs成骨诱导分化14天后的细胞作为实验组（记为D14组）,而成骨诱导分化前的细胞则作为对照组（记为DO组）。通过茜素红染色进行成骨分化鉴定。提取D14组和DO组细胞的总RNA,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测成骨特异性转录因子RUNX2、OPN、COL1A1的表达情况。从D14组和DO组中分别提取DNA,通过染色质免疫共沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq）,针对组蛋白乙酰化赖氨酸27（H3K27ac）细胞标记对提取的DNA进行高通量测序,对测序得到的数据进行ROSE（Rank Ordering of super-enhancers）算法分析,从而鉴定出D14组和DO组的超级增强子,并通过数据库获得其靶基因的信息。此外,从D14组和DO组的细胞中分别选择2个超级增强子靶基因进行Real-Time qPCR来验证测序结果的准确性。对所筛选出的超级增强子靶基因进行生物信息学分析。结 果对DO组细胞行茜素红染色,结果均为阴性。而D14组细胞行茜素红染色后可见明显的红色钙盐沉积,提示茜素红染色结果为阳性。利用Real-Time qPCR检测到RUNX2、OPN、COLIA1在DO组和D14组中的表达水平具有显著的差异,在D14组中表达显著增加。ChIP-seq结果提示DO组SEs有1680个。D14组中SEs为342个。其中D0组独有的SEs有1380个,D14组独有的SEs有42个,两组共有的SEs有300个。D0组的SEs所调控的基因有1680个,其中具有蛋白编码功能的有1094个,非编码蛋白的基因有551个。D14组的SEs所调控的基因有342个,其中具有蛋白编码功能的有223个,非编码蛋白的基因有116个。对D0组和D14组的超级增强子靶基因行KEGG分析,结果示TGF-β信号通路、PI3K-Akt信号通路以及ECM受体信号通路的均为高富集,且与成骨分化密切相关,尤其是TGF-β信号通路。对所选的4个靶基因行RT-qPCR的结果证实了测序的结果。结 论hBMSCs成骨分化过程中涉及了多个细胞因子及细胞通路的变化,SEs可能通过调控其靶基因的表达来调控hBMSCs的成骨分化。