lncRNA AARB07048878.1在ETU诱导的先天性肛门直肠畸形大鼠后肠发育中的作用研究

作     者：曹正浓 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贾慧敏

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：长链非编码RNA lncRNA 先天性肛门直肠畸形 大鼠模型 

摘      要：目的:先天性肛门直肠畸形是小儿外科常见的复杂消化道畸形,分型及病理改变复杂,治疗困难,严重影响患儿生命及预后。现阶段对于该疾病的研究多集中在基因水平,而对于基因的具体调控机制尚待进一步发现。本研究利用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）诱导先天性肛门直肠畸形大鼠模型,对末端后肠组织进行高通量测序,探索差异表达的lncRNA AARB07048878.1在肛门直肠畸形大鼠中的表达水平变化,通过对其进行干扰及过表达探索其在IEC-6细胞中的功能,推测其疾病发生中的作用。研究方法:①Wistar孕鼠42只分为ARM组和正常组,孕GD10分别按125mg/kg给予ETU及等量生理盐水灌胃,孕GD16、GD17、GD19剖宫取胎,转移至无菌操作环境下取材,GD16、GD17于显微镜下,GD19于肉眼下观察胎鼠骶尾部形态,计算胎鼠畸形率,对存在肛门闭锁、短尾或无尾畸形的胎鼠收集末端后肠组织。②利用荧光定量PCR技术检测ARM组及正常组胎鼠末段肛门直肠组织中的lncRNA AARB07048878.1表达水平差异。③设计lncRNAAARB07048878.1的特异性干扰序列Ribo lncRNA smart silencer 及过表达质粒,用 riboFECT CP Reagen 将特异性干扰序列转染IEC-6细胞,用Lipofectamine 3000将特异性过表达质粒转染细胞,采用CCK-8试剂法检测细胞增殖能力变化,流式细胞术检测细胞凋亡率变化。④对lncRNA AARB07048878.1被干扰及过表达后的IEC-6细胞提取总蛋白,采用Western blot检测细胞中Wnt5a蛋白的表达水平变化。⑤统计学分析,所有实验均设三组重复样本,qRT-PCR结果用2-ΔΔCT表示相对表达量,western blot条带用ImageJ软件进行半定量分析,实验数据采用SPSS 24.0软件及Prism 8.0行分析,两两比较采用独立样本t检验,P0.05认为差异存在统计学意义。结果:①相比正常组,ARM组胎鼠在孕16d、17d、19d时lncRNA AARB07048878.1表达下调,其中17d时下调显著,差异具有统计学意义（P0.05）;②干扰lncRNA AARB07048878.1表达后抑制细胞增殖能力,促进细胞凋亡（P0.05）;③过表达lncRNA AARB07048878.1后提高细胞增殖能力,抑制细胞凋亡（P0.05）;④干扰lncRNA AARB07048878.1 表达后,Wnt5a 蛋白表达降低（P0.05）;过表达 lncRNA AARB07048878.1 后,Wnt5a 蛋白表达增加（P0.05）。结论:综上所述,本研究在组织及分子水平上观察ARMs发生中lncRNA的变化及作用,发现lncRNAAARB07048878.1通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡参与ARMs的发生发展,其作用可能通过抑制Wnt5a的表达实现,我们也将通过进一步实验探究lncRNA AARB07048878.1对Wnt5a调控的分子机制。本研究结果为进一步探究lncRNA对ARMs发生发展的分子机制提供实验基础,为ARMs的早期发现与治疗提供新的靶点与思路。