基于PRRSV人工感染鄂通两头乌筛选抗病指示性状和候选基因

作     者：高国丽 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘榜;周翔

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：HP-PRRS 鄂通两头乌 病毒载量 体重增长 血常规指标 转录组 指示性状 抗病候选基因 

摘      要：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种以各年龄段猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率为主要特征的病毒性疾病。迄今为止PRRS的防控方式主要有生物安全和疫苗接种,目前PRRSV商业化的灭活疫苗主要是基于单个的PRRSV毒株,对高度变异的PRRSV感染没有发挥很好的保护作用,而弱毒疫苗可能出现毒力返强等问题。因此在遗传水平上增强宿主对PRRS的抗病性,实施抗病育种,为PRRS防控提供新的方法。本课题组通过人工感染PRRSV后发现通城猪与大白猪相比表现出较强的抗病力,两品种在临床症状、细胞因子水平、血常规指标、肺部病理损伤程度、血清中的病毒载量等性状存在显著差异。进一步利用抗病性存在显著差异的大白猪与通城猪杂交,再经连续多代的横交构建了高代横交群体,这个群体是抗病性状基因定位和抗病基因鉴定的理想资源群体。因此,本研究利用自主构建的高代横交群体为研究对象,通过人工感染PRRSV后对病毒载量、血常规指标、体温、体重、存活力(存活与否及存活时间)等反应宿主抗病性的指标进行测定,并对所测定的性状进行分析来筛选抗病指示性状。选择抗病和易感两极端个体进行外周血转录组测序,筛选抗病候选基因并进行信号通路分析。主要结果如下:1. 利用大白猪×通城猪高代横交群体进行PRRSV人工感染,测定感染不同时点的病毒载量和增重、血常规指标等性状,分析变化规律利用已构建的PRRS抗病的通城猪与易感的大白猪高代横交群体中的72头仔猪进行PRRSV人工感染试验,观察其临床症状,收集感染第0-35天的体温和临床症状,进行血常规指标、病毒载量和体重的测定。结果显示PRRSV感染后陆续出现各种临床症状,体温持续升高到感染后第6天,最高体温达43.9℃,平均体温41.2±1.1℃,以后体温略有下降但仍高于正常体温,第10天后以锯齿形式逐渐降低直至正常体温。感染第7天出现个体死亡,第10天为死亡的高峰期,第14天后平缓、19天后稳定。病毒载量在第0-4天升高,第4天达到峰值并持续到第7天,第7-35天病毒载量逐渐下降至6 logcopies/m L。PRRSV感染后第0-4天体重增长速度缓慢,第4-21天体重一直呈负增长、第7-11天体重减少量达最大值、第21-35天体重呈正增长且增长量逐渐增加。第4,7天与感染前第0天相比,白细胞计数、淋巴细胞百分比、单核细胞计数均都极显著降低(P0.01),粒细胞百分比极显著升高(P0.01)。以第14天存活与否划分为抗病和易感两组,其中抗病个体36头、易感个体36头,分析抗病组和易感组的病毒载量、体重增长和血常规指标的差异,抗病组和易感组在病毒载量、体重增长量、血常规指标等性状都存在显著差异,抗病组的病毒载量在第4、7、11天显著低于易感组(P0.05);抗病组的体重增长量在第7-14天均显著高于易感组(P0.05);抗病组和易感组的淋巴细胞百分比和粒细胞百分比在感染后第7天存在显著差异,其中抗病组的淋巴细胞百分比显著高于易感组(P0.05),粒细胞百分比显著低于易感组(P0.05)。分析这些性状之间的相关性来筛选PRRS抗病指示性状,结果表明第7天病毒载量和第7-11天体重增长都与感染后14天存活呈中度相关,4种血液性状与病毒载量也呈中度相关。根据这种相关性可通过早期的病毒载量高低和体重增长量以及4种血液性状的变化来判断个体抗过病毒感染而存活下来的可能性,因此早期病毒载量和体重增长以及4种血液性状可作为PRRS抗病性的指示性状。2. 通过转录组测序分析人工感染PRRSV后不同时间点的抗病个体和易感个体外周血基因表达差异为了从转录水平上研究抗病个体和易感个体对PRRS抗病性的差异,选取PRRSV感染前第0天和感染后第4、7、11天的抗病个体(7头)和易感个体(10头)的外周血白细胞(简称外周血)进行转录组测序分析。首先对不同时间点的外周血进行时序分析,发现感染后第4天与感染前第0天相比有2422个差异表达基因、感染后第7天与感染前第0天相比有1717个差异表达基因,感染后第11天与感染前第0天相比有3372个差异表达基因;通过KEGG、GO富集分析发现第4天特有的差异表达基因富集在细胞分裂和分化,可能对猪的生长发育存在影响,感染后第7天特有的差异表达基因富集在wnt通路和信号传导上,可能在免疫反应中发挥作用,感染后第11天特有的差异表达基因主要富集在转录后加工和翻译后修饰。在HP-PRRSV感染后的不同阶段宿主发挥的的免疫应答途径不同。其次用加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)抗病组和易感组不同时间点的外周血RNA-seq数据,发现turquoise、blue两个模块中的转录本与病毒载量和体重增长相关性强,在这两个模块中抗病组特有的差异表达基因数量较少,抗病组和易感组共有的差异表达基因主要富集在免疫通路,易感组特有的差异基因主要富集在免疫通路和信号传导通路;易感组特有的RASGRP1,CD247,MALT1,NFATC1共4个差异表达基因富集在T细胞受体信号通路上。