干扰素调节因子7影响狂犬病病毒致病性的分子机制研究

作     者：吕磊 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：傅振芳;赵凌

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：狂犬病病毒 干扰素调节因子7 致病性 抗病毒天然免疫 抗原递呈细胞 Ⅰ型干扰素 中和抗体 

摘      要：狂犬病(Rabies)是一种被狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的人兽共患病。RABV属于嗜神经病毒,其病理症状主要为致死性的脑炎,出现发病症状后致死率接近100%,目前缺少有效的治疗方法。目前大多数发达国家采用在宠物广泛疫苗接种的手段基本消灭了人间狂犬病,而对于医疗卫生条件落后的发展中国家而言,狂犬病仍是极大的威胁。由于加大了对狂犬病的防控,自2007年以来我国狂犬病发病人数从2007年的3302例降为2017年的516例,总数降低了84.37%。但从当前形势看要在2030年消除人间狂犬病的目标仍然十分艰巨。目前RABV的致病机制研究领域中仍存在许多未解之谜,亟待深入研究从而为狂犬病临床治疗方案的开发奠定基础,早日解除狂犬病对人和动物的威胁。干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)是诱导Ⅰ型干扰素(interferons,ⅠFN)产生的重要参与者,凭借着调控多种细胞因子参与到天然免疫和适应性免疫中。据报道,相比WT小鼠,IRF7小鼠对西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)更易感,但未有研究表明IRF7是否在RABV感染过程中发挥作用。因此,本课题利用IRF7小鼠来探究IRF7对RABV致病性的影响。在后肢肌肉攻毒条件下的致病性实验中,IRF7小鼠相比WT小鼠表现为发病时间提前和死亡率升高,说明RABV在IRF7缺失情况下致病性增强,暗示着IRF7参与RABV感染诱导的外周免疫应答激活。利用RT-q PCR检测感染部位、脊髓和脑组织中的病毒载量,发现缺失IRF7小鼠各组织中病毒载量均高于WT小鼠,值得注意的是,两者在感染早期感染部位病毒量存在差异,说明分布在外周中的IRF7抑制了RABV在后肢大腿肌肉部位的复制。为了探究IRF7抑制RABV复制的机制,一方面,我们检测了引流淋巴结中各种细胞因子的表达水平,其中MCP-1、MIP-1α和MIP-1β的表达水平在缺失IRF7后受到影响。了解到MCP-1、MIP-1α、MIP-1β三者都隶属于趋化因子中的CC家族,主要负责单核细胞在机体内分布和动态平衡,推测IRF7可能通过诱导趋化因子的产生参与免疫细胞如p DC、c DC和巨噬细胞向淋巴结内招募。利用流式细胞术比较发现,在感染后的第4天和第6天,IRF7小鼠引流淋巴结中这三种细胞的数量皆少于WT小鼠,这与我们的推测相符。另一方面,为了探究p DC、c DC和巨噬细胞在被RABV激活后IRF7如何直接发挥作用,我们用RABV分别直接感染这些体外诱导的细胞群,检测细胞上清中的病毒滴度以及胞内病毒基因组、IFNα和ISG的表达水平,发现IRF7参与p DC和巨噬细胞抑制病毒以及诱导IFNα和ISG的表达的过程,而在c DC中IRF7作用不明显,分析可能是因为IRF7的本底水平具有细胞特异性。在中枢感染条件下的攻毒实验中,IRF7小鼠相比WT小鼠表现为发病时间提前,死亡率升高,脑各分区中的病毒载量更高,说明IRF7在中枢感染情况下也能影响RABV致病性。检测两种小鼠中枢中各种细胞因子的表达水平发现,缺失IRF7后中枢几乎丧失产生IFNα的能力,而各种炎症因子的表达水平却比WT组高,利用脑组织切片发现IRF7小鼠脑内炎症和病变情况更为剧烈。外周和中枢的IRF7都参与RABV感染引起的机体抗病毒应答。在外周,IRF7一方面促进p DC、c DC和巨噬细胞的招募;另一方面参与诱导p DC、c DC和巨噬细胞中IFNα和ISG的表达。在中枢,IFNα的产生在一定程度上受IRF7调控。