在自身免疫甲状腺炎中硒蛋白P对ICAM1的影响及作用机制研究
作者单位：中国医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：安丽
授予年度：2020年
主 题：自身免疫甲状腺炎 硒蛋白P DNA甲基化 细胞间黏附分子1
摘 要：目的:自身免疫甲状腺炎（Autoimmune Thyroiditis,AIT）是常见的内分泌系统疾病之一。AIT主要特征是甲状腺中存在浸润的淋巴细胞且血清中存在过氧化物酶抗体（Thyroglobulin antibody,TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（Thyroid peroxidase antibody,TGAb）等甲状腺自身抗体,其症状以炎症破坏为主,女性患病率高于男性。浸润的淋巴细胞主要为T细胞和B细胞,其中T细胞在甲状腺自身抗原的刺激下产生并释放细胞因子,如干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL1-β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等。在这些细胞因子的刺激下,原本在甲状腺细胞中不表达的炎症因子出现了高表达的现象,如细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM1）。这些炎症因子又可以进一步促进炎症的发展。研究表明,AIT患者甲状腺细胞ICAM1高表达的原因是表观遗传学修饰发生异常。在甲状腺细胞中本应被高甲基化修饰的ICAM1启动子区域改变了正常应维持的甲基化状态,导致基因异常高表达。IFN-γ等细胞因子是否通过降低甲基化状态来刺激ICAM1的高表达尚不明确。硒是人体必需的微量元素,在体内发挥着重要的生理、生化功能,如抗氧化、抗衰老等作用。硒主要以硒蛋白形式在机体内发挥其生物学功能。其对生殖系统、免疫系统和甲状腺功能的重要性已经确立,对人类健康极为重要。硒蛋白如硒蛋白P（Selenoprotein P,SEPP1）可以保护甲状腺细胞免受氧化损伤,调节甲状腺激素的合成、活化和代谢过程。有研究报道,硒状态对于整体和基因特异性甲基化有影响。然而,SEPP1是否能够通过改变ICAM1启动子区域甲基化水平从而下调其表达水平,进而保护甲状腺细胞免受炎症损伤,尚有待证实。本研究采用体内外实验相结合的方式,探究SEPP1的抗AIT作用及其可能的机制,研究结果可以进一步阐述AIT的发病机制以及为探寻该疾病的有效防治方案提供理论依据。方法:1.人群研究:本研究纳入40例女性研究对象,研究对象的甲状腺功能指标FT3、FT4和TSH均在正常范围内,其中20例TPOAb或TGAb高并且HE染色可见淋巴细胞浸润的甲状腺组织纳入自身免疫甲状腺炎组（AIT组）,20例TPOAb或TGAb在正常范围并且HE染色未见淋巴细胞浸润的甲状腺组织纳入对照组（Control组）。于手术中获取甲状腺组织,分离甲状腺细胞。qRT-PCR和免疫组化方法检测ICAM1 mRNA和蛋白表达水平,一代测序方法检测ICAM1启动子区域甲基化率,qRT-PCR和免疫组化方法检测硒蛋白SEPP1 mRNA和蛋白表达水平。2.体外研究:设立IFN-γ处理组和对照组,两组中的Nthy-ori 3-1甲状腺细胞系分别用含1000U/ml IFN-γ的无血清培养基和无血清培养基处理24h,按上述方法检测ICAM1mRNA表达水平,ICAM1启动子区域甲基化率,SEPP1 mRNA表达水平。用IFN-γ诱导ICAM1高表达的细胞模型后,给予0μM、0.5μM、1.5μM、5μM亚硒酸钠处理24h、48h、72h、96h,检测ICAM1 mRNA表达水平,按上述方法检测ICAM1启动子区域甲基化率。3.用SPSS 20.0对结果进行统计分析,P0.05时判定差异有统计学意义。结果:1.人群研究:1.1 AIT组研究对象年龄和性别与Control组无统计学差异,AIT组血清中TSH、FT4水平与Control组无统计学差异,血清中FT3水平虽然有统计学差异,但是入选人群的FT3水平均在正常范围内。AIT组血清中的TPOAb、TGAb表达高于Control组,差异有统计学意义（P0.05）;1.2 AIT组甲状腺细胞中ICAM1 mRNA和蛋白表达水平高于Control组,差异有统计学意义（P0.05）;1.3AIT组甲状腺细胞中ICAM1转录起始位点（TSS）上游-163bp、-64 bp、-20 bp、-18bp处甲基化率低于Control组,差异有统计学意义（P0.05）;1.4 AIT组甲状腺细胞中SEPP1 mRNA和蛋白表达水平低于Control组,差异有统计学意义（P0.05）。2.体外研究:2.1 IFN-γ处理组SEPP1 mRNA表达水平低于Control组,差异有统计学意义（P0.05）,ICAM1 mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P0.01）;ICAM1转录起始位点（TSS）上游-179bp、-163 bp、-125 bp、-102 bp甲基化率低于Control组,差异有统计学意义（P0.05）;2.2亚硒酸钠处理甲状腺细胞系72h和96h后,ICAM1 mRNA表达水平呈浓度依赖性降低;-163bp、-125bp甲基化率呈浓度依赖性升高。结论:SEPP1可能通过提高ICAM1启动子区域甲基化水平而降低ICAM1在甲状腺中的表达,进而保护甲状腺免受损伤。
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