不同浓度CB对小鼠纺锤体移植后重构卵的细胞骨架及囊胚发育的影响

作     者：王启航 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张雷

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：细胞松弛素B 纺锤体移植 细胞骨架 微丝 重构小鼠卵 

摘      要：目的:线粒体DNA疾病是致病性线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mt DNA）突变引起的线粒体功能障碍性疾病。线粒体替代治疗可以预防致病性mt DNA向子代的传递。虽然临床已有通过核质置换技术出生的婴儿,但是实验过程中获得的大多数人囊胚质量相对较差,可用于移植的人囊胚率极低。因此,目前阶段提升核质置换技术效率和重构人囊胚的质量,成为我们研究的重点和难点。本研究做小鼠卵纺锤体移植时,使用不同浓度的细胞松弛素B（Cytochalasin B,CB）处理,先比较电融合和仙台病毒（HVJ-E）融合的融合效率,再检测重构小鼠卵的细胞骨架和统计重构小鼠胚胎发育情况,筛选出小鼠卵纺锤体移植的最适CB浓度,为提高人类纺锤体移植技术提供可靠的实验数据。背景:本研究是在国家重点研发计划“线粒体遗传疾病治疗的辅助生殖新技术研究中的课题3“线粒体遗传病的筛查及核质置换技术的临床转化应用研究的基础上进行,前期赴上海交大和中科院神经所进行了核质置换技术的培训,熟练掌握了该技术的各种操作,在对操作技术的研究中明确了纺锤体移植和应用病毒融合的方法的效率最高,而这种方法的难点是CB浓度的选择,因此,针对此问题进行了更深一步的研究。方法:选择同种品系C57BL/6小鼠卵母细胞做纺锤体移植,先比较电融合和HVJ-E融合的效率,再分别使用3.5μg/m L CB（A组）、7.5μg/m L CB（B组）、10μg/m L CB（C组）、12.5μg/m L CB（D组）四个不同浓度的CB处理纺锤体移植过程,包括去核（在本研究中每6-8枚卵为一组,操作时间控制在30min以内。将准备好的卵放在含有不同浓度CB的工作液中孵育5min。用Holding针固定小鼠卵位置,把纺锤体摆成梭形,放在12-1点钟位置,再用去核针将纺锤体-染色体复合物取出）、注核（将取出的核转移到稀释1/20的仙台病毒工作液中,浸泡10-15s,然后注入到另一个去核的卵中,在将注核和去核的胞质进行挤压,利于融合）1.比较不同浓度仙台病毒的融合效率;2.统计小鼠纺锤体移植效率,包括去核率、注核率、融合率;3.统计正常小鼠卵和重构小鼠卵的受精率、卵裂率、囊胚率、孵化率;4.对各组小鼠囊胚行免疫荧光染色检测,在荧光显微镜下计数细胞总数;5.对各组重构小鼠卵的细胞骨架行免疫荧光染色检测,在激光共聚焦扫描显微镜下观察重构小鼠卵的微丝、微管恢复情况。结果:1.A组、B组的重构小鼠卵做仙台病毒融合,稀释1/20倍比稀释1/10倍的HVJ-E融合效率高;2.A组、B组、D组的重构小鼠卵与C组的重构小鼠卵相比,纺锤体移植效率无差异（P0.05）;3.A组、B组、C组、D组的融合小鼠卵与对照组的正常小鼠卵相比,受精率、卵裂率,无显著差异（P0.05）,D组囊胚率、孵化率显著降低（P0.05）;4.A组、B组、D组的重构小鼠囊胚与对照组的正常小鼠囊胚相比,囊胚细胞总数均显著降低（P0.05）;C组的重构小鼠囊胚与对照组的正常小鼠囊胚相比,囊胚细胞总数无显著差异（P0.05）;5.A组、B组、C组、D组重构小鼠卵母细胞融合后,0h、1h、2h的微丝恢复比率基本无差异;6.A组、B组、D组重构小鼠卵的微丝呈现不均匀分布,C组重构小鼠卵的微丝呈现均匀分布。结论:1.小鼠卵纺锤体移植,稀释1/20倍的HVJ-E融合效率好;2.本研究选择的CB浓度不影响重构小鼠卵的纺锤体移植效率、受精率、卵裂率,但影响重构小鼠卵的囊胚率、孵化率及囊胚总细胞数;3.10μg/m L CB浓度为小鼠卵纺锤体移植过程的最适浓度;4.本研究选择的CB浓度不影响重构小鼠卵的微丝恢复比率,但影响重构小鼠卵的微丝恢复状态。